Kary B. Mullis
一、摘要：
DNA聚合酶連鎖反應（Polymerase Chain Reaction , PCR）是Kary B.
Mullis博士於1983年的一個夜晚忽然靈機一動想出來的方法，當時他是Cetus生物科技公司的研究員，這個發明使他獲得了一萬美元的公司獎勵。PCR技術給基因的分析和研究帶來了一個革命性的大轉變。以往基因分析的困難在於必需在複雜而多達10萬個基因的基因組（genome）中去尋找極為稀少的標的基因，所用的方法頗為費事，包括基因的選殖（gene
cloning）和測定特殊的DNA順序等等。PCR技術將這些都改變了。它使我們不必再藉著cloning也不必將某段的DNA順序分離出來，即可以將此段極少量而俱特殊順序的DNA，依指數倍數複製成為極多的複本(9)。PCR的過程已經可以完全自動化(10)。而這項技術也使得Mullis博士獲得了1993年諾貝爾化學獎。
二、得獎者簡介：
 Mullis博士在1944年12月28日出生於美國南卡羅來納州(South Carolina)的里諾市(Lenoir)。根據他所回憶，由於他成績不夠好而無法和其兄長般順利地進入著名的長春藤院校下，他選擇了以理工所長的喬治亞理工學院(Geogia
Institute of Technology)並於1966年獲得了化學學士學位。之後Mullis進入加州大學柏克萊分校(U. C. Berkeley)攻讀生化學研究所，在1972年以一篇討論宇宙物質平衡的論文「Schizokinen:Structure
and Synthetic Work」獲得了生化博士的學位。研究所畢業以後，他在柏克萊大學任講師至1973年。而后四年他在堪薩斯大學醫學院就讀博士后。從1977年到1979年他在加州大學舊金山分校從事化學製藥的博士後研究工作。從1977年到1986年的七年時間裡，Mullis進入了加州Cetus生物科技公司成為一位研究DNA化學技術員(15)，並且在這個時期孕育了PCR的構想。
對於這項獲得諾貝爾獎的發明，相傳著以下頗具戲劇性的起源。有別於一般嚴謹的研究開發。Mullis築建起PCR技術構思於美國西岸的128號公路，經由舊金山(San Francisco)往門朵西諾(Mendocino)的途中。他說：「我最好的構思通常在開車時產生」這位外表像個衝浪者多過科學家的諾貝爾獎得主，於是在時速90公里的本田喜美房車裡發明了簡稱為PCR的聚合酶連鎖反應(12)。這項在Cetus生物科技公司任內所做的發明使Mullis獲得了一萬美元的公司獎勵。他所始料未及的是，這技術的發明不僅為生物高科技領域的一次革命，也得到了諾貝爾委員會的青睞，讓他獲得了1993年諾貝爾化學獎。其專利原屬Getus公司，後破記錄的以三億三千五百萬美金的價格出售給全球最大的製藥廠—瑞士Hoffman-LaRoche 公司，而使得PCR這個技術成為了前史上最貴的發明專利。同年他還獲得了國際科學屆最高榮譽獎之一的日本獎。1986年他成為Xytronyx公司分子生物研究所主任。1987年起他成為眾多企業的核酸化學技術顧問。90年代以後，Mullis博士慢慢了淡出了學術界和他工作多年的生物科技界。他以演說，周遊世界和研究，收集資料和寫作維生(14)。
三、卓越貢獻：
(一)背景介紹
PCR的發展可以說是從DNA合成酵素的發現緣起。DNA合成酵素最早於1955年發現
(DNA polymerase I), 而較具有實驗價值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 則是於70年代的初期由Dr. H.
Klenow 所發現。PCR的原始雛形概念是類似基因修復複製 (DNA repair replication)，它是於1971年由Kjell
Kleppe博士提出。他發表第一個單純且短暫性基因複製 (類似PCR前兩個周期反應) 的實驗。而現今所發展出來的PCR則於1983由Kary B.
Mullis博士發展出的，Mullis博士當年服務於Cetus生物科技研究公司 (Perkin-Elmer Cetus Corporation)。Mullis博士並於1985年與
Saiki 等人正式表了第一篇相關的論文。此後，PCR的運用一日千里，相關的論文發表質量可以說是令眾多其他研究方法難望其項背。在 1989 年，Science
將PCR中的DNA合成酵素命名為當年的風雲分子 (Molecule of the year)，而PCR本身則列為年度的重要科學發明產物。當然，它的原發明者Mullis博士更在往後獲得諾貝爾的桂冠(10,13)。
但1985年Mullis最先發表的PCR論文中所使用的DNA聚合酶是先前提過由大腸桿菌中萃取純化的DNA聚合酶-Klenow
fragment，由於這個酵素是一種易被熱所破壞之酵素，所以於每一次複製把模板DNA加熱分開成單股後，就得加一次DNA聚合酶。但是若想把複製次數增加到二十至三十次時，上述方法變得繁瑣不堪，且因試管中變性的DNA聚合酶逐次增多，會妨礙DNA的產量。還好，中國人的發現改變了兩難困境。現任教於陽明大學神經科學研究所的錢嘉韻教授，早在1976年留美時即已報告了一項新發現：由美國黃石公園溫泉所分離出的某種細胞（Thermus
aquaticus, YT-1），其DNA聚合酶具有耐高溫的特性。該篇論文還詳述了此DNA聚合酶的純化步驟，以及此酵素的相關特性。例如，複製DNA的最適溫度（高達80℃）、最適pH值、二價鎂離子（Mg2+）的必要性，以及此酵素有別於E.
coli的DNA聚合酶，並不具有外3'à 5' exonuclease之效等等。此篇論文後來被Mullis所在Cetus公司工作的PCR發展小組所應用。以Thermus
aquaticus的DNA聚合酶，即Taq DNA polymerase，取代了先前所用的E. Coli的
Klenow fragment。這項改變使得PCR反應得以自動化(10)，只需在第一個複製循環時加一次Taq DNA聚合酶，即可連續複製三十個循環以上，所得DNA片段的特異性比用E.
Coli的酵素要好得多。整個反應可使微量的DNA模板於二至三小時內，在一根試管中複製百萬倍以上。如此一來，PCR變得既省力、省時又省錢。Cetus公司的研究小組於1988年重新整合PCR過程，發表了改用Taq
DNA聚合酶後的PCR方法及其應用之潛力(11)。
(二)DNA聚合酶連鎖反應Polymerase Chain Reaction
(PCR)之原理介紹
聚合酵素鏈鎖反應(PCR)是一個利用酵素對特定基因做體外或試管內
(In Vitro) 大量合成的技術(14)。其原理十分簡單，先在要擴增的DNA片段兩端分別設計一個前置引子(forward primer)和反置引子(reverse
primer)，然後將溫度提高使得雙股的目標DNA變性成單股，在將primer與已變性的單股目標DNA配對結合後，利用DNA聚合酵素(DNA polymerase)以目標DNA的兩股分別做為模板(template)來合成新的DNA股，如此週而復始，就造成了產物以2n 的速率急速地增加(2,12)。
若要詳細了解PCR的技術原理，首先要知道PCR反應需具備的要件和材料料，分別如下：
(1)要被複製的DNA模板(Template)
(2)界定複製範圍兩端的引子(Primer)：包括了前置引子(forward primer)和反置引子(reverse
primer)，可分別和DNA的雙股倍對結合，作為合成新股的起點。
(3)DNA的合成酵素(Taq Polymerase)：將四種核甘酸催化聚合成一新的互補的DNA鏈。
(4)合成的原料及水：其中包括dNTP(包括了dATP、dTTP、dCTP、dGTP等四種核甘酸)，還有提供合成酵素作用環境的緩衝液(Buffer)。
知道了PCR反應需具備的要件之後，進入PCR的反應過程，PCR的反應包括了三個步驟，分別是(1)Denaturation、(2)Annealing、(3)Elongation三個步驟：
(1)Denaturation：以高溫，通常在92℃-95℃之間，使雙股DNA變性而分開成單股的DNA，以作為往後複製的模板。〈如下頁圖二中的B小圖所示〉
(2)Annealing：使引子(Primer)於一定的溫度下，通常在40℃-52℃之間，附著於單股的模板DNA上做配對結合。〈如下頁圖二中的C小圖所示〉
(3)Elongation：單股的DNA作為模板(Template)，以引子(Primer)為起點，在DNA的合成酵素(Taq
Polymerase)的催化及適當溫度的作用下，Taq聚合酵素的有效作用溫度為72℃，將四種核甘酸催化聚合成一與Template互補的DNA鏈。〈如下頁圖二中的D圖所示〉
完成了這三個步驟即為一次循環(11)，循環操作每次可使DNA的量添加一倍，若重複操作多次，以數學公式計算，DNA增加的量將會是2n
(12) ，n是代表重複操作的次數。在理想的聚合酵素鏈鎖反應條件下，DNA是以幾何級數增加。而之前曾經提過，由於Taq
Polymerase的應用，已簡化PCR繁瑣的步驟，這項改變使得PCR反應成為可以自動化的一項技術。
A：將要複製的雙股DNA
B：雙股的DNA經加熱後成為單股的DNA
C：單股的DNA與Primers (圖c的２個小方塊) 經Annealing 的步驟而配對結合於各別股的一端
D：Polymerase經Elongation的步驟由Primers為起點依箭頭的方向進行延長合成反應
E：經由B,C.D三個步驟後，一份的雙股DNA就變成兩份的雙股DNA，如此的周期一再重覆就會使得原來的特定DNA得以連鎖複製。
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▲圖二
DNA聚合酶連鎖反應 (PCR) 的基本流程示意圖
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四、未來展望：
PCR在分子生物的領域確實帶來不少的震撼和影響；更重要的是它大大地加速了生物科技領域研究的腳步(9)。PCR除了是一個研究工具外，更重要的是它已被廣泛地應用在學術、工業和醫學上的研究。在學術方面，例如DNA序列的直接分析，DNA及細胞種類的分析，基因突變的定位，基因表現與選殖；在工業方面，例如：水質及食品檢驗等。在醫學方面，PCR本身可直接用來鑑定特定基因的存在與否，也可以用來偵測基因是否有異常。例如對遺傳疾病或腫瘤癌症的診斷及預後的評估或對細菌、病毒及黴菌感染的診斷。PCR也可成為一個生產線進而大量複製特定的基因進行基因密碼的讀取
(DNA sequencing) 及其他的運用。舉凡對生物標本及法醫學上的樣本鑑定，從單一毛髮、一隻精蟲或一滴血液、唾液來找出兇手。也可以做DNA指紋
(Fingerprints) 比對幫助親子關係的鑑定(1,6)。PCR更可以用於器官移植組織相容性HLA的分析，近來，在生物醫學的研究上，特別是細胞間訊息的傳遞分子，諸如介白質
(Interleukines) 及各種生長因子 (Growth factors) 基因的表現都可用PCR來進行質與量的分析(10)。另外在演化上的分析，經由PCR的運用也產生重大的進展，科學家已成功用此技術對一個兩千外年前被埋在琥珀中的昆蟲遺傳物質進行了擴增，而加以研究(1,15)。
總之，人類在進入廿一世紀即將出現若干的突破，生物醫學便是其中重要的一項。在過去三、四十年來，像PCR這樣影響深遠的技術實在很難找到。它的震撼,
除了得到眾多的獎項外〈包括諾貝爾獎〉，更在於它的可塑性、修飾性及全方位的運用。未來的生物醫學領域中，它也必定繼續扮演舉足輕重的角色。
▲圖四
琥珀中昆蟲的遺傳物質也可以PCR的方式來擴增
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五、參考資料：
1.
http://www.nobel.se/
2.
http://www.nobelchannel.com
3.
http://www.infoplease.com/ipa/A0777579.html
4.
http://focus.aps.org/v2/st19.html
5.
http://www.mednobel.ki.se/
6.
http://www.bc.edu/bc_org/avp/cas/chem/acs-inoraginic/Nobel.html
7.
http://www.britannoca.com/nobel/
8.
http://www.medlib.ncku.edu.tw/people/1993.html
9.
http://www.tactri.gov.tw/htdocs/project/proj56-2.htm
10.
http://www.cgmh.org.tw/intr/intr2/c3100/pub/10info.htm
11.
http://binfo.ym.edu.tw/edu/biol_basis/pcr.htm
12.
http://wine1.sb.fsu.edu/bch5425/lect22/lect22.htm
13.
http://bioteach.ttu.edu.tw/highschool/polymera.htm
14.
http://www.chtf.com/big5/forum/forum_people/kary_b.htm
15.
http://bioclass.cs.ntou.edu.tw/biolab/2_MolBio/exp2-1/5_ans3.htm
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