蛋白晶體學

結構分子生物學是研究生物分子結構與其生物功能機制間的關係進而改造生物分子(如蛋白質工程)或開發其抑制藥物(藥物設計)的一門科學 ( 參1 )。主要內容即研究生物大分子的三維結構和功能。也就是說，結構分子生物學是以生物大分子結構及其運動的測定為基礎來闡明生命現象的科學。由於研究方法的不斷成熟和改進，配合分子生物學提供的研究基礎、途徑和對象不斷拓展，近年來此一領域的研究進展十分迅速，使得人們對那些重要生物大分子(如核酸、蛋白質、糖和脂類等)的結構功能關係之了解有了許多突破。

完整、精確地測定生物大分子三維結構的主要研究對象包括核酸、蛋白質、寡糖、脂類及它們之間的複合物。目前採用的研究方法主要有：X射線單晶繞射分析 ( 亦稱晶體結構分析 )、二維和多維核磁共振 ( NMR )技術、電子繞射分析 ( 電子結晶學 )、掃描隧道顯微技術 ( STM )和原子力顯微技術 ( AFM )以及計算機和資料分析技術等。

由於蛋白質為生命體構成的主要物質，亦是生命活動的主要承擔者 ( 參5 )，研究蛋白質分子的三維結構和功能對生物製藥等蛋白質工程具有十分重要的意義。蛋白質晶體學研究便是利用X射線單晶繞射分析 ( 亦稱晶體結構分析 )技術來了解蛋白質的三維結構。其中過程涵蓋了蛋白質樣品製成、結晶、X射線繞射、結構解析及功能解釋等方面內容，涉及生物物理和生物化學、結構化學、凝聚物理、物理化學和計算機等多學科知識，是典型的交叉學科。蘊含著豐富的未知規律，期待人們去探索和研究。

蛋白質晶體結構分析首先要將蛋白質高度純化，培養成晶體，再利用X射線繞射法分析蛋白質晶體中每個基團和原子的空間定位。進行步驟大綱如下 ( 參4 )：

1. 製作蛋白質晶體與重金屬衍生物

2. 繞射數據的收集

3. 數據計算

4. 解決相位問題

5. 獲得電子密度圖

6. 大分子模型建立

2.蛋白質純化

欲獲得晶體，蛋白質分子的純度和均一性是能否獲得完美結晶的關鍵之一( 參2 )。重組DNA技術在這方面是一個很重要的幫助。由蛋白表現質體所獲得的蛋白質能夠快速獲得純化，並且只需很少的純化步驟就能得到均一的樣品。一般來說，一個蛋白質樣品想要使其能結晶，至少需要95%的均一性，且盡可能地減少溶液中的化學物。

此外，要純化蛋白質之前，通常要先了解以下蛋白質的特性：

物理特性

1. 蛋白質是否會凝集

2. 蛋白質是否會吸附於純化管柱或膜上

3. 蛋白質經過分離後保持穩定的時間

化學特性

1. 蛋白質是否有雙硫鍵形成

2. 蛋白質是否會被金屬離子活化

蛋白質特性

1. 蛋白質如何保持穩定狀態

2. 蛋白質所適合的溫度

3. 蛋白質所適合的pH值

4. 蛋白質所需的添加物 (如抑制蛋白酶的EDTA)

5. 造成蛋白質不穩定的化學成分

3.蛋白質結晶原理

要利用X射線單晶繞射分析技術來了解蛋白質的三維結構，首先就是要獲得蛋白質晶體。因此要迫使分子結晶的動力和動力學體系相同，即是使自由能達到最小，此時吸引作用--電的、空間的、疏水的、親水的作用達到最大，而分散或排斥力減至最小。對於生物大分子，如蛋白質，通常它們達到完全溶劑化時，才達到自由能最小。在濃溶液中，沒有足夠的水維持完全溶劑化（或說使大分子相互之間隔開），大分子因此沈澱或結晶。聚集作用過快，往往産生非晶態沈澱，一般來說，應使不完全溶劑化過程儘量減慢，讓分子有機會把自己排列到晶格中( 如圖1；參15 )。大分子會因其形狀、多價特性和物理性質，及溶液濃度、pH、溫度等因素影響下，會有不同的最小溶解度。因此，要使大分子結晶的方法，即讓溶液體系非常緩慢趨向溶解度最小，進而達成過飽和狀態 ( 參3 )。

圖1. 蛋白質晶體由成千上萬的相同蛋白質所組成

由於球狀蛋白分子量較大，而且表面分子結構較不穩定，欲獲得排列有序的晶體是比較困難的。所形成的晶體不會是完美的堆砌，在分子間會有許多間隙( 如圖2；參15 )。這些分子間隙通常常由佔晶體體積一半以上的溶劑分子所佔據，這些溶劑分子的絕大部分在晶體中是無序排列的。晶體的蛋白質分子間又僅有少量的區域發生接觸，通常是藉由溶劑分子來交互作用。這也是為何由X射線晶體學測定的蛋白質結構與在溶液中測定的蛋白質結構幾乎相同的主要原因。

圖2. 蛋白質晶體間會形成許多間隙

a.蛋白質晶體生長

蛋白質體生長的復染性使之成為蛋白質結構解析的限速步驟 ( 參5 )。因此，對蛋白質晶體生長方法進行系統的研究尤其重要。目前蛋白質晶體生長已逐步擺脫了其經驗和技藝性質，成為專門的研究領域。借助於實驗室的先進儀器，我們可以運用計算機模擬等方法對常用的蛋白質結晶方法進行了系統的研究，獲得了一系列重要的結論。同時還探索有發展前途的新的晶體生長方法。

b.蛋白質晶體生長的調控

蛋白晶體生長過程不利於生長高質量的蛋白質晶體 ( 參5 )。在方法研究的基礎上，通過深入研究各種重要因素對晶體生長影響的規律，針對最常用的汽相擴散和液相擴散晶體生長方法，提出可行的晶體生長調控和條件優化方法，目的是生長出更高質量的蛋白質晶體。目前已獲得初步的實驗結果。其中汽相擴散晶體生長的調控技術已應用於蛋白質結晶裝置的設計。 SHAPE \* MERGEFORMAT

4.蛋白質結晶之方法

當蛋白質分子從飽和溶液中慢慢地沉澱，晶體便可析出。生長蛋白質最常用的方法是汽相擴散，其原理是利用含蛋白質的晶體生長液 ( 母液 )與不含蛋白質，只含金屬或有機溶劑的擴散液 ( 外液 )之間沉澱劑的濃度梯度，蛋白質溶液中的溶劑水分子在此濃度差下逐漸向沉澱劑濃度高的外液擴散，而使蛋白容易達到飽和狀態，並在此緩慢過程中蛋白質分子形成規律排列而結晶( 如圖3；參15)。以下就蛋白質結晶法做探討。

圖3. 蔬菜的RuBisCo結晶

a.蒸氣擴散法(Vapor Diffusion)

在蛋白質晶體的製作上，我們最常用的方法是蒸氣擴散法( 參11 )。此種方法的原理是利用將一滴含有某一種沈澱劑( precipitant )之緩衝液( buffer )的純蛋白質溶液置於一含有大量高濃度之相同溶液之密閉容器內，再來因兩者緩衝液濃度的差異( 容器內溶液濃度 > 蛋白質溶液濃度 )而為了使兩者濃度相同( 平衡 )，蛋白質溶液內之水分子開紿氣化轉移到容器溶液內而使沈澱劑濃度增加，如此也使得蛋白質濃度漸漸增加致可結晶的狀態而慢慢析出形成結晶 ( 圖5，參15 )。而此種裝置有下列幾種(如圖4-a,b,c；參14)：

圖4-a Hanging drop diffusion 圖 4-b Sitting drop diffusion

圖 4-c Sandwich Drop diffusion 圖5.以hanging drop 之方法

所形成之結晶形態

b.透析法(Dialysis)

透析法( 參14 )是利用小分子物質( 如水分子、離子、緩衝液、鹽類等 )在溶液中可自由通過半透膜，而大分子物質( 蛋白質 )不能通過的性質，使得水分子易於通過透析膜而往高濃度之緩衝液去,如此使蛋白質溶液漸漸達飽和而慢慢形成結晶之方法( 如圖6-a,b )。

圖6-a 蛋白質結晶之透析法之圖示圖6-b 蛋白質透析結晶之裝置

在這兩種蛋白質結晶的方法中，最常用的方法為蒸氣擴散法。而此法在製作蛋白質晶體時之條件( 緩衝液和沈澱劑等條件 )到現在並無一特定的規律。但我們知有下列因素會影嚮蛋白質之結晶：

c.影响蛋白質結晶化之因素

樣本（蛋白質）的濃度’、純度、製備條件、保存條件、新鮮度
樣本（蛋白質）的特性（膜蛋白、糖蛋白、官能基等）
沈澱劑的種類、濃度、純度等
溫度
ｐH 值(如圖7)
還原劑、酸化劑的有無
基質、補酵素的有無
特殊金屬離子的存在的有無
緩衝溶液的種類和濃度
結晶化的時間
其它(振動、清潔) 圖7. 蛋白質結晶化之pH

附圖：

表一. 篩選蛋白質結晶之緩衝液之範例

圖8. 主要之沈澱劑之種頪和使用頻率

圖9. 製作蛋白質結晶之工具VDXM plate

5.蛋白質體晶體學在結構生物學上的應用

生命體的一切活動都是通過它的基本構成物質，特別是蛋白質和核酸的功能來實現的，而這些生物大分子的功能又直接取決於它們的結構。因此，測定這些生物大分子的結構，並研究其結構與功能之間的關係，這對於揭示生命奧秘和理解疾病如何產生十分重要。而且這也是發展蛋白質工程及藥物設計等生物高技術所必需的基礎，特別是在人類基因組計劃完成之後，這類研究更加突顯出其意義( 參8 )。

各物種的基因體序列 (Genomic sequence) 大致都已陸續完成，如何有效地利用這些大量的新資訊將是一個相當大的問題，然而下一步更重要的就是要如何去了解這些基因的產物『蛋白質』的功能；蛋白質在生命體內扮演許許多多重要的調控、構成的角色，包括如何調控生物反應的步驟，（結構生物）在這一方面的研究將是一個非常重要的技術。由於各方面技術的快速進步及成熟，包括a.同步輻射蛋白質Ｘ光束之建立、b.便宜高速電腦的推陳出新、c.結構分析軟體之快速發展及進步、d.微量蛋白質結晶方法之成熟、e.新穎蛋白質之表現及純化等等，已促成一門研究新領域『結構基因體 ( Structural genomics)』之發展，結構基因體研究可以快速的解出蛋白質的立體構造，並以此來瞭解蛋白質對生物的功能機制，也可借助一些生物物理方法來研究蛋白質特性(蛋白質化學) ，進而能作蛋白質工程或抑制藥物的開發( 藥物設計 )，並協助許多生物科技技術上及醫藥上的應用和疾病上的分析研究。

6.蛋白質晶體學目前的應用

a.研究疾病

利用分析蛋白質晶體的結構，來分析研究疾病的原因；例：鐮刀型紅血球貧血症的患者的血紅素中的β-chain上的Glu6 被突變為 Val胺基酸，而使這個位子的結構改變。如圖Glu6改變成Val後結構呈凸出狀，在不含氧的狀態下β1-chain上的EF corners會凹陷，而和另一個deoxy-hemoglobin S的Val作結合而聚合，最後使紅血球呈鐮刀狀。（圖10.）(參9)

圖10. hemoglobin Val的結構及生物反應

b.研發藥物

分析了解HIV 蛋白脢的結晶結構

HIV蛋白脢是兩個相同的蛋白質分子共同組成並且形成一個活性區域。我們希望藉由可以與活性中心作用的natural substrate molecules結構，製造出類似物質結構的蛋白質或化學物質的抑制劑，並進一步希望這些物質能夠可以取代natural substrate molecules而可以抑制HIV 蛋白脢的表現。（圖11）(參9)

圖11. HIV蛋白脢的立體結構，及其藥物的研發

Xenical（Orlistat）:

是由Streptomyces toxytricini（鏈球菌的一種）微生物所提煉出來的減肥藥劑，在坊間又稱為羅氏鮮、讓你酷；Xenical為一種胰或小腸解脂肪素的抑制劑（Lipase Inhibitor），當脂肪在進食後，會在小腸內給胰臟分泌出來的解脂肪素 (Lipase) 分解為小份，才能被吸收以至儲存。Xenical的藥性是去抑制解脂肪素 (Lipase)，阻礙脂肪分解，未能被分解的脂肪體積太大，不能被吸收，終被排出體外。為什麼Xenical可以當作脂肪酵素抑制劑，因其結構與三酸甘油酯相似，故可在小腸和三酸甘油酯競爭lipase，干擾lipase消化脂肪，這是一種可逆性的脂肪脢拮抗劑，這也就是說，它會取代脂肪，接到脂肪脢上面，讓脂肪無法接合，也就無法分解。用更簡單的話說，Xenical會佔據脂肪脢讓脂肪脢沒有辦法與脂肪接合，也就沒有辦法分解脂肪，如此一來，脂肪就原封不動地通過消化道，無法分解，無法吸收，直接排出體外，Xenical可有效干擾lipase分解脂肪，但只能阻止百分之三十的脂肪吸收量，這百分之三十的脂肪會由糞便排除至體外。(參16)(參17)

7.台灣在蛋白質晶體上的未來展望

在美國 NIHGMS 以成立了『結構基因體中心』一共有七個。建立這中心計畫之目標是在五年過後，預期每一中心每年可解出 100-200 蛋白質構造，也就是在將來的五至十年之中將會有數千個新蛋白質結構將會被解出。因此台灣希望可以由國科會支持建立〝國家型結構蛋白質體中心〞，以期台灣在國際上此一重要領域能佔有一席之地，且可用以協助發展台灣之生科產業。初期結構解析方面將以 X-ray 結晶繞射技術為主。如果計畫進行順利，未來可考慮加入核磁共振技術，以循序漸進的方式進展。其他相關之重要技術之建立有(1) 同步輻射蛋白質光束站之建立及使用(2) 利用直接進化 (direct evolution) 及 rational design 之蛋白質工程研究 (3) 蛋白質體分析(4) 快速蛋白質純化生產，包括無細胞蛋白質合成 (5) 單株免疫蛋白之技術(6)酵母菌 two-hybrid 技術來發現新的蛋白質複合體。

這個計畫的重要目的是能快速解析許多蛋白質的3D結構。最近許多重要的結構，例如 50S 及 30S ribosome都是利用超耐高溫菌的蛋白質來培養出高品質的晶體，但我們希望以更進一步跨生物種 (cross species) 之方式，以期找出最適合養晶的蛋白質。

這個計劃將來在研究題目的選擇上將會著重於三個方面的考量：

第一方面：膜蛋白質之結構與功能從已知的基因序列資訊，我們可以發現在已知基因中膜蛋白質約佔 30%-40%，然而到目前為止只有很少的膜蛋白構造被解出，因此他們希望能以群體計畫方式來建立一個小組在此一方向做有系統的研究分析。

第二方面：在生物科技上有實用價值的蛋白質本土生物科技發展應有其獨特性，我們希望選擇一些在產業經濟有應用性及經濟性的蛋白質題目。

第三方面：與疾病醫藥研發可應用之相關蛋白質，國內在一些本土性疾病的研究已有相當高程度的成果。尤其在腸病毒、肝炎、烏腳病、登革熱、免疫等。對於藥物發展、疾病治療等有關之蛋白質可由結構生物方法來探討( 參6 )。

8.參考資料

1. http://www.dls.ym.edu.tw/t7.htm

2. http://biochem98.myrice.com/papers/struchem/028.html

3. http://life.nthu.edu.tw/~rrandd/89s1/b871636/ssh10b.htm

4. http://biochem98.myrice.com/papers/struchem/025.html

5. http: //www.ibp.ac.cn/06/admission/bosses/ 2003/071010/huaixingcang.html

6. http://domino.tmu.edu.tw/bioinfo.nsf/0/7f81abd86954131b482569b2000e59c6?OpenDocument

7. http://www.people.com.cn/BIG5/kejiao/42/154/20010111/376600.html

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11. http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

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14. http://www.hamptonresearch.com/support/cg101.html

15. Introduction to Protein Structure. Carl Branden & John Tooze. chapter 17

16. http://hammer.ingpim.com.tw/ohayo/health/secret/female/n_fight_1_xv.asp?docid=6946

17. http://www.kmu.edu.tw/~kmcj/data/9108/12.htm