mRNA-peptide fusion

口述：張文章 老師

整理：陳郁鴻

 

mRNA-peptide fusion

利用linkage每一protein與encode其之DNA sequence（例如mRNA-peptide fusion），做為在in vitro製備nucleic acid-encoded peptide和protein libraries有效率的方法。

 

    在技術方面的考量有別於ribosome display，因為ribosome display過程中可能遭遇ribosome-mRNA-peptide複合體較不穩定的問題，不易於selection時維持其複合體的完整性，因此以peptide與mRNA之covalent linkage的方法在技術上較具優勢。藉由一種抗生素－puromycin，為aminoacyl-tRNA analogue作covalent linkage。

 


    Puromycin分子依附於DNA spacer接在mRNA 3’-end，於in vitro translation時當ribosome停於DNA spacer，末端的puromycin－aminoacyl-tRNA analogue則進入ribosome的A site並與peptide產生linkage，此法亦稱mRNA display。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

圖（Figure 7.）顯示典型的mRNA display實驗：

首先將DNA library於in vitro轉錄出mRNA library

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合成含puromycin於3’-end之30-bp DNA sequence，並接合至total mRNA

↓

以mRNA-DNA-puromycin hybrid molecular進行in vitro translation，

得以puromycin共價結合之mRNA-peptide複合體

↓

再經isolation、reverse transcription，和利用specific antigen作selection

↓

篩選到的複合體進行PCR放大，可用作定序或轉譯等進行其他實驗

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

                                                                                                Figure 1：mRNA-protein fusion synthesis

 

 

（a）     雙股DNA模板於in vitro轉錄mRNA模板

（b）    與biotinylated puromycin-linker作用

（c）     固定於neutravidin beads

（d）    washing並除去unbound mRNA

（e）     將beads照射UV light

（f）      elute出photo-ligated mRNA-puromycin template以用來進行in vitro translation構成mRNA-protein fusions library

 

T7：transcription promoter sequence

 

TMV：a portion of the tobacco mosaic virus 5’-UTR with good initiation codon context

 

random 10 Fn3：a sequence coding for a randomized 10th fibronection type III domain

 

const：a constant sequence which codes for the linker hybridization and crosslinking sites as detailed in Fig. 2

Pu：puromycin

 

Pso：psoralen

 

PC-biotin：a photo-cleavable biotin-tag described in Fig. 2.


 

 

 

Figure 2：設計之mRNA 3’-end模板和puromycin-linker序列

 

mRNA-peptide fusion方法的缺點

＃所有步驟皆是in vitro情況下進行

＃對membrane proteins或必須post-translational modification之proteins則不易操作

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

參考資料

＃Discussion on the paper: H. Lin and V.W. Cornish.  Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function Angew. Chem. Int. Ed., 41, 4402- 4425 (2002).

 

＃http://mirror.ensta.fr/molecules/papers/51201259.pdf