Phage Display
整理：朱浤毅
4.參考資料
Phage display一種和蛋白質表現及研究有關的重要技術之一，一些令人有興趣的蛋白質研究都開始採用這種方法來進行。噬菌體提供了蛋白質和蛋白質所屬的基因間物理上銜接地點。M13這一種噬菌體是較常用在phage display的攜帶者，M13噬菌體是一種單股DNA分子的噬菌體，它的DNA分子被成千上萬的外套蛋白分子所包圍著。這些外套蛋白是由噬菌體本身的DNA所做出來的。在phage display的技術中，是將會做出我們有興趣之蛋白質的DNA序列結合在噬菌體的DNA上，而這一個接合位置便是此技術的最重要地方，接上的序列能否順利表現或是利於研究分析，都是取決於所接上的位置好壞。既然是要利於研究，當然是希望接上的序列所表現出的蛋白質能在噬菌體的表面出現，因此首先要做的事便是分析噬菌體的蛋白質外套之序列。經過分析的結果發現，蛋白質外套最主要的成分是成千上萬個重複的pⅧ序列所做出的pⅧ蛋白，另外兩端的部分分別由五個copies的pⅢ和pⅥ以及五個copies的pⅦ和pⅨ所做出的蛋白質所構成的，這個結果出來之後便確立phage display所欲用來接合的位置了，之後可利用噬菌體來表現欲研究的蛋白質序列。
Phage display的原理很簡單，只是將欲表現的序列在in vitro的環境下，將之接在外套蛋白的序列之後，接著便利用一些方式(例：電擊、加熱等)將所建構出的phage particles轉化入進入勝任細胞中，接著便進行培養來得到我們想要研究的phage particles，這些噬菌體顆粒中都帶有一種獨特的DNA分子。由這個樣子來看phage display好像沒有什麼難處，其實不然，這個技術令人頭痛的困難之處也是不少，例如說要如何純化出帶有我們要研究之序列的噬菌體，這一個問題在1985年時，一位名叫Smith的研究者採用了親和性色層分析法來處理phage particles之後便提高了樣品的純度。此方法很簡單，在此以EcoRI endonuclease fragment來作說明，首先將此片段嵌入噬菌體pⅢ基因之後，要注意的是修飾過後的噬菌體要能保有生存力和感染力。之後便去培養，經過一連串的實驗證明，發現外來蛋白可以表現在噬菌體表面上。培養完之後便將溶液放到一個培養皿上，這個培養皿不是普通的培養皿，此培養皿的表面覆蓋著一層anti-EcoRI endonuclease antibody，使得有表現EcoRI gene的噬菌體顆粒會被吸附住，而其他不要之雜物便可以先沖出，之後在將吸附的的顆粒elute出來便可以得到高純度的噬菌體顆粒，藉由此方式將可以大量提高樣品的純度。
自從smith的改善方式提出之後，現在對於phage display還有一些技術上的改進，例如利用helper phage進行co-infection來提高phage基因表現的效價，此外還有藉著調控外套蛋白pⅢ和其他外套組成蛋白來控制基因表現的效價，或是進行phage surface的多樣組成表現。在一次研究中發現到pⅢ蛋白是由三個區域所構成的(N1、N2以及CT)，N1區域和感染力有關，是最主要的一個區域。N2是和F-pilus及一些增進感染力之helper的特殊辨識有關，這一部份不是必須存在的。CT是外套的一部份，主要和噬菌體的型態發生有關。於是一種利用外套蛋白結構調控的技術(selectively infective phage、SIP)便產生了。Duenas和Borrebaeck最早證明了這方法的成功，他們將 anti-hen-egg white lysozyme(HEL)antibody fragment表現在噬菌體外套蛋白上，而此phage的pⅢ蛋白缺少了N1區域，結果發現到噬菌體失去了感染力，但是若給予表面上表現出HEL-N1聯合蛋白時，此蛋白具有和anti-HEL antibody fragment相結合的能力，當兩種蛋白之間互相結合之後，pⅢ的功能會恢復同時噬菌體的感染力也跟著回復了，而利用此方式進行phage display可以提高表現量。
SIP和傳統的phage display相比較之下有兩個較好的優點，第一是此方式在進行affinity-panning(純化步驟)時速度會比普通的phage display快，第二就是此法可以藉由修飾不同的外套蛋白來使phage surface表現出多種的外來蛋白。不僅可以加快實驗的時間，還可以突破原本的技術上極限(舊式的phage display只能在表面表現一種外來蛋白)。
在phage display的幫助之下，phage display peptide libraries得已被建立，peptide libraries的建立為proteomes的研究帶來不少的便利之處，藉此搜查倒是到的蛋白質表現序列，例如在peptide ligands、enzyme inhibitors等方面。Phage peptide libraries現在在商業商業上有許多利用的價值，其中最廣泛的領域是在抗體工程上。在此最主要的困難是如何成功的在phage surface表現抗體蛋白。1990年時有研究顯示，抗體主要是由light chain以及heave chain兩個領域，表現這兩個領域之基因的變化性非常高，也因此同一條的基因序列能做出成千上萬種不同的抗體分子。在phage surface上可以表現出所謂的Fv片段(VL、VH結合在一起的單股片段)，之後更陸續有研究證明在phage surface上也能表現出Fab片段(一段具有VL-CL、Vn-Cm的heterodimer片段)，不同的phage antibody libraries包括immunized、nonimmunized以及synthetic libraries等，已經被利用在分離新的抗體及改善現存的抗體對特定抗元的親合力，藉此提高抗體所表現出的活性及專一性，來得到更高的利用價值。
首先將我們認為是我們要研究之蛋白的基因片段(不確定是不是正確正確的蛋白質基因序列)接在噬菌體基因區中會做出pⅢ外套蛋白的序列之後，之後將此修飾過的噬菌體顆粒轉化入勝任細胞中(利用電擊、加熱或是加入氯化銫等方式)，之後進行培養來使外來蛋白表現在噬菌體表面上，在此所表現出的蛋白會位於pⅢ表面蛋白之後，之後便利用antigen-antibody的方式來確認所表現出的蛋白是否為我們所要的蛋白，若不是則重新進行修飾飾菌體的DNA分子直到表現出為止，若表現出的蛋白是我們所要的，那接著便利用高鹽或低pH值得溶液去將phage particles由dish中elute出來，然後便將序列基因拿去定序，確認出蛋白質的基因序列，之後便可進行各類的研究及分析。經過了一些實驗技術上的改進，使的phage display更能對proteomes之研究，提供合適的研究方式。
抗體是在醫療界中用來治癒病人的一種利器，因為抗體這種蛋白質是在我們的身體裡會製造分泌出來的物質，主要功用便是用來抵抗入侵的外來物質，因此在醫療方面抗體便是一種醫療聖品。在西元1990年時，McCafferty等人首先想到利用phage display的技術將抗抗體具有變異的區域(VH/VL)的部分，利用單鍵鍵結(single chain Fv，scFv，fig.1)的方式將此片段聯結在噬菌體上，
藉此在噬菌體上表現出來，同時模擬抗體的主要結構和主要功能，便誕生了所謂的噬菌體抗體。之後更有人對於建構噬菌體抗體的結構加以深入研究，成功的將VH和噬菌體pⅢ蛋白基因相結合，兩段相融合後再將VL段接上去，形成雙鏈的結構稱為Fab(fig.2)。
隨著噬菌體抗體的廣泛應用與研究，Clackson等人構築了第一個噬菌體表現抗體的基因庫，他們利用抗原免疫小白鼠的基因，並設計出primer，藉由此primer來對小老鼠的抗體基因進行RT-PCR並進行選殖，之後再利用噬菌體抗體的技術，將所選殖出的抗體基因藉由噬菌體抗體來表現，隨著實驗數據的累積並處理便誕生出所謂的噬菌體抗體基因庫。接著便可以在in vitro中利用抗體-抗原的親和力來進行篩選，找出我們所需要的抗體，之後便利用噬菌體本身所具有的感染力來進行培養，解此得到大量的、具有高度專一性的抗體，以便應用在醫療方面。
此外由於近幾年來各國的十大死亡原因之首，大都是惡性腫瘤位居第一，因此科學家們便想到利用癌細胞表面所具有的特殊表面抗原，用這些被稱為腫瘤抗原的antigen，利用注射的方式打入小白鼠體內來進行免疫反應，之後再利用phage display的方式製造出對癌症細胞具有高度專一性的抗體，藉由此專一性抗體來鑑定人體內的癌細胞抗原，確認是否有癌症產生，另外也利用此抗體發產出藉由標定癌細胞的來治療癌症的方法，替癌症患增加一條光明之路，多了一份希望。
另外也有一批研究人員利用phage display的技術分離出一段peptide，這段peptide經過分析鑑定之後，發現此peptide能和細胞表面上的PA63七聚體產生鍵結，之後研究人員便將此peptide和polyacryamide衍生物相接之後進行實驗結果發現到此段物質具有在試管中抑制毒素復合物的生成，後來在動物實驗中也證明了此物質具有阻斷毒性物質的功能。這一項新的發現對於一些病患的臨床治療帶來一項新的契機，此外這個發現還提供了阻斷性藥物製作的一個新的思考方向，有助於改善藥物的功能，提高治療的效果。
為何phage display這個方法被光範例用在製造抗體呢？這是因為利用此方法製備抗體時所需要的時間和金錢都比以傳統方式製造抗體來的省錢及快速，還有以傳統方式製造出來的抗體有時會被視為是外來入侵物質而被我們自身的免疫系統所清除掉，反而失去了功能還造成不必要的浪費，而利用phage display所製造出來的抗體對人類而言並非是所謂的外來物質，因此比較不會引起免疫反應的發生，而能達到治療的效果，另外由於動物體能有所謂的tolerance mechanisms的存在，因此有些抗體無法利用動物來製造出來，這時phage display便是一個很好的選擇方式。因此phage display目前最普遍應用的地方是在抗體的製造，根據它的快速、大量及方便性而被廣泛使用。
4.參考資料
1.Discussion on the paper: H. Lin and V.W. Cornish. Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function Angew. Chem. Int. Ed., 41, 4406- 4409 (2002).
2. http://home.kimo.com.tw/unibiotech
3. http://140.112.78.220/~brc/Research/New.htm
4. http://www.zo.ntu.edu.tw/personal/b87205102/phage/advantage.htm
5. http://www.zo.ntu.edu.tw/personal/b87205102/phage/preparation.htm
6. http://www.dyax.com/phage/howitworks.asp
7. http://www.healthtech.com/2002/pgd/