N-hybrid System

整理：王勇力

2.Protein-DNA Interactions

3.protein- small molecule interactions

不同的yeast n-hybrid systems，所討論的為 protein- protein、protein- DNA， protein–RNA 和 protein- small molecule 的相互作用。（下圖）

Yeast n-hybrid systems分成的類型：（A）protein- protein（B） protein- DNA （C）protein–RNA （D）protein- small molecule interactions。

A) 在起初的 yeast two-hybrid system，啟動reporter gene 的 transcription 作用，是藉由重新組合activation domain (AD) 至 promoter region 的機制，原理是 protein X 融合至 DNA-binding domain (DBD)， protein Y 融合至AD，經由這些挑選 protein X 和Y 的相互作用後是否有啟動reporter gene，而知蛋白質之間是否有相互作用。

B) 在 one-hybrid assay 中， AD直接融合至 DBD。這個 assay 可用來尋找結合特殊DNA序列的DBDs。

C) three-hybrid system 常用來偵測 RNA-protein 的相互作用：hybrid RNA molecule，一側的hybrid RNA 是 RNA (R) 高特異性的結合至 MS2 coat protein (MS2)，好像錨似的作用。另一側是 RNA X ，可與protein Y作用，可用來測試RNA-protein 的相互作用。其原理和（ a）相同。

D) 另外一個 yeast three-hybrid system，能被用來偵測 small molecule protein 。Ligand L1可和 protein X 相互作用，並和ligand L2和protein Y作用，reporter gene transcription 作用會被啟動。其原理和（ a）相同。

1.Protein-Protein Interactions

Uetz 和 Glot ，藉由PCR放大各個ORF，並且 cloned 至pGBK-RC(為 Gal4 DNA-binding domain-based bait vector （MATa）)和pGAD-RC (為 Gal4 activation domain-based prey vector（MATα）)【此為融合的方法】，藉由再一次的PCR跑電泳後，確定有插入序列，轉至96孔盤，看有表現mark基因，來篩選Protein-Protein Interactions。因為mark基因可製造必須胺基酸（培養基缺乏mark基因那種必須胺基酸），如果Protein-Protein Interaction會啟動基因，則可製造必須胺基酸而存活（下圖）。

文字方塊: Protein-Protein Interaction
模式圖

最近，Brent 等使用 identify peptide aptamers 方法，以peptide結合至TrxA的模式，利用 surface plasmon resonance，來篩選Cdk2，由於高特異性的性質可提升靈敏度。（下圖）

2.Protein-DNA Interactions

1983，使用Mnt protein（82 amino acid repressor 屬於DNA binding protein 中的ribbon-helix-helix家族）His6 變為 Pro variant ，對 Mnt opernon 序列上5,17（G,C）變為（A,T）有專一性，為最早使用的DNA binding protein。

近年，Pabo等利用 bacterial two hybrid assay 發展 zinc finger，作用原理和Protein Protein Interactions類似，只是篩選使用read-out的方法。

3.protein- small molecule interactions

為 two-hybrid assay 的延伸，利用 bridging small-molecule 或 RNA 成為 yeast three-hybrid system。近來，Licitra和Liu發展的模式為DBD–FKBP12-【Dex-FK506】-LexA-glucocorticoid-AD，其中【】代表small molecule。

4.補充資料

Surface Plasmon Resonance (SPR)

SPR - Surface plasmon resonance 是一種利用光折射，其中的thin metal films因為目標物質結合，使得電子移位，改變折射係數的現象，利用感應器可偵測其現象的技術。

Surface plasmon resonance detection unit. L: light source, D: photodiodephotodiod array, P: prism, S: sensor surface, F: flow cell. The two dark lines in the reflected beam projected on to the detector symbolise the light intensity drop following the resonance phenomenon at time = t₁ and t₂. The line projectedprojeted at t₁ corresponds to the situation before binding of antigens to the antibodies on the surface and t₂ is the position of resonance after binding.

Yeast two hybrid assay

作用概念圖：

Protein-RNA Interactions作用概念圖：

5.參考資料

1. J Pelletier and S Sidhu (2001): Mapping protein-protein interactions with combinatorial biology methods. Curr. Opin. Biotechnol. 12, 340-347.

2. http://www.astbury.leeds.ac.uk/

3. IG Serebriiskii et al. (2001): Redefinition of the yeast two-hybrid system in dialogue with changing priorities in biological research. Biotechniques 30, 634-655.