1.Genetic assay

Genetic methods對於酵素活性的篩選和選擇上提供了一特殊且有力的幫助。早在1940年代，一個古典的實驗中，Beadle 和 Tatum 這兩位科學家便使用了遺傳學的分析方法去鑑定酵素在必須代謝物中的生物合成其所扮演的角色。這兩位科學家採用了一種方法，對Neuospora crassa (一種子囊菌類)的染色體DNA上，利用X-rays的方式做隨機突變。在得到約2000個突變株後，我們將這些突變株分別培養在豐富營養的培養基中和僅含有Neuospora所需要最微量且其無法自行合成的營養物(如biotin)的培養基中。經過實驗後，發現了自含營養豐富的培養基中所取出的三株突變株和wild type相較之下，並無很大的區別，而反之在僅含minimal 的培養基中，其突變株的生長速率是非常差的。藉由加回個別的代謝物至minimal 的培養基後再去測量其生長速度，結果發現這三株突變株分別無法合成維他命B6,維他命B1，和p-aminobenzoic acid(圖1)。由此基礎的方法去突變DNA去encoding在蛋白質上，再去測量一些可以偵測到的表型(如生長速率)便是遺傳學分析方法的基礎。

目前許多已知功能的基因便是用此方法測出，不只基因，且數以千計的蛋白質的功能也由此得知。Beadle 和 Tatum 兩位科學家的供獻在於指出突變株的篩選可以藉由酵素活性的方法達到。(圖1)

2.方法一colormetric assay

我們選取了一反應其中他的產物具有螢光性，舉例來說明，Arnold和co-workers使用過氧化氫做為輔酶去產生P450的變化，簡單地來說，我們利用error prone PCR，一種可以在基因上產生任意突變的技術，去使得encode在cytochrome P450上的基因產生random mutations。Naphthalene，分子式為C₁₀H₈及所謂的駢苯，在E.coli內被做為基質，首先先經過P450(variants)的催化而產生hydroxylation，而後再經由horseradish peroxidase 的催化而產生了oxidative coupling，這個產物由於其本身具有螢光性(圖A)因此，內含P450變化的細胞便可以用螢光數位影像去偵測出來(如圖B)。經由實驗證明，在第一輪中，有200000個菌株被拿來測量，大部份的菌株呈現出增大的螢光反應，其中有三株突變株則顯現出約比一般的wild type P450高10倍的活性。而在第二輪實驗中，我們利用了Staggered extension process(StEP)去將五株突變株做基因重組，再去測他們的後代，結果發現了他們的活性比一般的wt P450高約20倍。由此我們可以推出一個結論，當P450的酵素活性被增加越多，則所能測到的突變株數目就越多‧

在圖(C)中所表示的意義是第二代突變(second generation of mutants)後所產生進70000的clones，圖中可以看出wild-type P450，第一代的突變株M7-6H，和第二代的突變株S3-20和S3-27的螢光強度可自圖中看出。

3.方法二‧complementation

除了在遺傳學分析的效用外，complementation對於發展推斷蛋白質的新功能似乎提供了一自然的選擇。這方法不是去測突變顯型中complementation的染色體片斷，而是當一個蛋白質被突變後，並去發展推斷至補足到一已知的顯型。Yano和co-workers將aspartate aminotransferase至分枝的amino transferase 來說明此方法。首先，他們設計了一E.coli拿出其wild type branched-chain aminotransferase的基因，使此菌株除非在有提供Val,Ile,和Leu的培養基中，方能存活。接著將wt aspartate aminotransferase 利用DNA shuffling的技術(DNA shuffling: 一基因族，具有closely homologous genes，經homologous recombination，造成DNA shuffling，產生一chimeric library，其中可能產生新活性)去產生突變與重組(圖2)

(圖2)

並移入到E.coli內。經過五輪的突變與篩選，在每一輪中有10⁶-10⁷的突變株被測量，而篩選的嚴謹度可以藉由改變培養基中2-oxovaline的濃度，酵素的表現層次以及培養的時間。在最後一輪的實驗後，含有13個點突變的突變酵素會被分離，其在β-分枝的amino acids的K_cat/K_m有10⁵倍的增加，而在asparate的K_cat/K_m則有30倍的減少。K_cat/K_m在此所代表的重要意義為可以調控篩選的嚴謹度，首先去偵測不充足的觸酶，最後則要求高的催化作用之反應。各別的測定13個點突變，結果發現只有6個點突變對於新的基質需要10⁵倍活性的增加。結果也發現了另一件事，6個突變對他們自己本身來說都是有益的，由此提高了一種可能性，蛋白質上的每一個位置能夠randomized independently。

4.參考資料

1. Discussion on the paper: H. Lin and V.W. Cornish. Screening and Selection Methods for Large-Scale Analysis of Protein Function Angew. Chem. Int. Ed., 41, 4413- 4414,4417-4418 (2002).

2. http://www.imbt.ntou.edu.tw/teacher/tsj/tsj.htm

3. http://www.bch.bris.ac.uk/staff/hadfield/Biotech2002/sld036.htm