蛋白質的交互作用
整理：施純如
在生物體中，蛋白質會彼此結合在一起，形成複合體，執行特殊的功能，這就是「蛋白質的交互作用」。功能單位有大有小，大如核糖體（ribosome）由30個以上的單位構成，小如轉錄因子（transcription factor）僅由2個組成。生化學家發現，幾乎所有的蛋白質都會與其它的蛋白質結合，或是透過不結合的方式，達到交互作用的目的，這種現象出現在高等動物（哺乳類）的頻率又高於低等的動物。因此，要了解細胞如何系統性運作之前，必須先了解蛋白質複合體如何共同執行功能；要知道蛋白質群體怎樣執行功能，就要先定義出這群複合體的組成。
欲明瞭群體中某蛋白質的功能，其線索在於結合的成員中，已經知曉功能的成員身上。例如，已知許多訊息傳導的蛋白激酶複合體（protein kinase signaling complexes），是由激酶（kinase，將磷酸根從ATP轉移到受體的酶）、磷酸酶（phosphatase，催化磷酸根由一化合物轉移到另一化合物上）、以及調控蛋白（regulatory protein）組成，其中激酶和磷酸酶的部份，可藉由分析它們的催化中心（catalytic domains），得知它們的基本生化功能，由此推斷複合體中的其它蛋白質，應屬於調控性質。
探測細胞層級的蛋白質結合，一般使用兩種實驗方法，一種是免疫沉澱（immunoprecipitation），如下圖：
先以蛋白複合體其中一種的抗體與其作用（在圖中，就是三角形蛋白質的抗體），抓下這個複合體後，以SDS-PAGE和Western blot的方式將蛋白質轉印到膜上，最後用橢圓形、霧狀、圓形等三種蛋白質的抗體偵測，如果都有反應，就證明了三角形、橢圓形、霧狀和圓形等三種蛋白質的確會形成複合體；這個方法的先決條件是，必須有這些蛋白質的抗體，否則像圖中的X蛋白質，雖然也是複合體的一部份，但因沒有抗體，所以無法被測出。
另一種方法稱為「yeast two-hybrid system」，以間接的方式測得兩種蛋白質的交互作用，如下圖：
Pr1和Pr2是我們所感興趣的蛋白質，Pr1和Pr2是這兩種蛋白質的基因，將兩種基因與轉錄因子（transcription factor）融合（fusion），結合在啟動子（promoter）上，表現於酵母菌（yeast）中。DBD代表與DNA結合的部份，（DNA-binding domain），AD是活化的部份（activation domain），唯有兩種蛋白質彼此結合，形成完整的轉錄因子，它們所啟動的reporter gene才能表現；換句話說，是依reporter gene的產物是否表現，來推論Pr1和Pr2是否有交互作用。因為這是一種間接的方法，實驗過程中可能遭遇到其它的問題而影響結果，像是融合的基因產物無法到達細胞核，或是無法在酵母菌中表現。
直接以質譜儀作為分析工具，提供了一種探測蛋白質複合體組成的新方法，下面是簡單的流程圖：
1代表我們所感興趣的蛋白質，與其它未知的蛋白質結合在一起形成複合體。將細胞萃取液以1的抗體作用，抓下蛋白質1，以及和它結合的物質（免疫沉澱），之後有兩種方法可以分析它，一種是電泳SDS-PAGE，染色後挑出蛋白質色帶（protein band），使用酵素分解它，最後用MALDI-TOF MS分析，藉由peptide mass fingerprinting algorithms 知道組成；另外，也可將膠體色帶中的peptide用LC-MS-MS得到MS-MS光譜（MS-MS spectra），比對database得到序列。使用SDS-PAGE可能面對的問題是，過程中會有蛋白質的流失，如分解膠體中蛋白質，分解得不完全，或是peptides從膠體分離出來的時候，分離得不完全。
除了電泳分離，還有一種方法，就是先用酵素分解，再用MALDI-TOF MS或LC-MS-MS分析，跳過電泳的步驟。如果複合體含的蛋白質在三個或三個以下，用MALDI-TOF分析是直接又簡單的方式，複合體的成員愈多，用MALDI-TOF spectra定蛋白質的難度就愈高，因此複雜的peptides混合物，通常選用LC-MS-MS spectra。
以抗體進行免疫沉澱（immunoprecipitation），是分離蛋白質複合體實驗中最常用到的方法。這個方法要能成功，首先要能取得適當的抗體，也就是能專一性抓到目標蛋白質，但在結合的同時，不影響目標蛋白與複合體其它成員的結合，因此並不是所有的抗體都適用於免疫沉澱。下面是免疫沉澱的簡圖：
在實際操作上，可以將抗體與當作支持物的「珠子」（beads）結合，再進行免疫沉澱，然後以1M的acetic acid這類的試劑進行短暫的變性作用（denaturant），使複合體與抗體分開，抗體以離心或過濾的方式回收，蛋白質複合體則進行酵素分解，送入MS分析。為了證明我們得到的蛋白質複合體，並不是在免疫沉澱過程中的人工疏失產物，還必須進行一些確認的工作，例如選用複合體中另一成員的抗體，進行免疫沉澱，同樣分離複合體、酵素分解、MS分析，比對兩種免疫沉澱結果是否相符。
一種不使用抗體抓蛋白質複合體的方法，稱為「bait」。將目標蛋白質固定在固體支持物上，如下圖A：
有許多方式可以把目標蛋白質連於beads，或是其它類似的支持物上。舉例來說，將蛋白質與活化的支持物（如epoxyalkylSepharose）作用一段時間，epoxyalkylSepharose會與蛋白質上親核性（nucleophilic）的-NH2（amine）團基，或是硫基（thiol group）共價鍵結；如果在蛋白質上標定His-tag或FLAG-tag sequence，使用鎳樹脂（nickel resins）或抗FLAG的抗體就能抓住此蛋白質。
把和bead結合的蛋白質與細胞萃取液，或是其它種類的蛋白質混合物一起培養，這些蛋白質形成的複合體會與beads結合在一起，將這一群體以離心或過濾的方式收集下來，經酵素水解和MS分析，便能得到複合體的蛋白質資料。
使用「bait」的優點有兩個：其一，不使用抗體，不干擾MS的分析；其二，不必擔心抗體是否能辨識複合體中的目標蛋白質。不可否認的，與支持物結合的目標蛋白，可能會影響它和複合體其它成員原本的結合力，例如它是以N端與支持物及其它成員結合的話，則兩邊的結合力會彼此干擾而減弱。Bait法的另一個缺點是，要讓目標蛋白質和支持物結合，比起單純購買抗體，所費的時間和金錢或許更多、更困難。
要確定bait法的正確性，可用「reverse bait」法，如圖B顯示。由bait實驗得到的結果，推知蛋白質複合體的組成後，我們挑選另一種蛋白質結合在bead上，重覆bait實驗，比對MS分析的結果看是不是相同。使用reverse bait法也許還能找到原本沒發現的複合體成員。
蛋白質除了能跟蛋白質結合外，它也能跟核酸上特殊的序列結合，轉錄因子（transcription factor）啟動子（promoter）的結合就是一例。研究蛋白質與核酸結合的方法，最常用的就是electrophoretic mobility shift assay，簡稱EMSA，如下圖所示：
將一段含有欲探測序列的寡聚核苷酸探針（oligonucleotide probe）以32P標定，與含有欲測蛋白質的細胞液（cell lysate）共同培養一段時間後，混合物以不變性的狀態（nondenaturing condition）跑洋菜膠電泳，未與蛋白質形成複合體的oligonucleotide 在膠體中移動得較快；反之，標定的、與蛋白質結合的oligonucleotide移動得較慢，由膠體上可以看出兩者的差異（圖中標示的「shift」）。
要了解與核酸酸結合的是哪些蛋白質，可以在電泳之前，先以抗體作用一段時間，如果此抗體確實與複合體結合，這個群體在膠體中的移動速度，又會慢於單純的核酸-蛋白質複合體，如圖中標示的「supershift」，這樣就能確定複合體其中一種蛋白質成份，在這裡，抗體的選用就很重要了。
切下shift和supershift的band，其中的蛋白質用酵素水解、MS分析，便能得知它的組成，但是得到的蛋白質，產量通常十分稀少，因此往往要重覆實驗數次，把得到的蛋白質一起分析。
除了傳統的EMSA實驗，我們也可以改良之前描述過的「bait」法，測試蛋白質-核酸的結合。將oligonucleotide與支持物結合，如下圖：
把oligonucleotide用生物素（biotin）標定，它能抓到會與它結合的蛋白質，連帶抓到此蛋白質形成的複合體，整個群體因為有biotin，所以能被帶有avidine的bead結合，非特異性結合的蛋白質，藉由洗脫的步驟去除，特異性結合的蛋白質便能純化出來，以酵素水解、MS 分析。
下圖是一連串以bait和reverse bait 方法探知「protein-interaction network」的流程：
A：以protein 1為起點，讓它與bead結合，將這個餌（bait）與細胞萃取液作用，酵素水解、MS分析，得知其它組成包括protein2、protein3和protein4。
B：Reverse-bait，方法同A，但把一開始結合在bead上的「餌」換成protein2，得知其它組成包括protein1、protein3、protein4，以及新發現的protein5。
C：把「餌」換成protein5，經過相同的實驗步驟，以MS分析的時候，找到了protein2、protein3、protein4，還有另一個新組成protein6。
這樣的分析可以一直循環，以確認組成的完整性。當然，要把蛋白質餌與支持物結合在一起，是相當花時間的，因此若有適合的抗體，也可以選用免疫沉澱的方式交替使用。
Daniel C. Liebler Introduction to Proteomics-Tools for the New Bioloogy p151~164
Humana Press Inc. (2002)