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蛋白質的定序
七、Dansyl-Edman步驟(Dansyl-Edman procedure) 八、蛋白質胜肽定序儀(Protein peptide sequenator) 九、Aminopeptidase的水解(Hydrolysis with aminopeptidases) 十、羧基末端方法(Carboxyl-terminal methods)
蛋白質的定序，是由數種不同的切割技術推導來的。通常胜肽能從胺基末端或羧基末端連續切割的方式研究，盡量簡化順序分析，並且儘可能地綜合重疊資料。雖然目前已有高度可靠的方法，但是仍會用重複試驗的方法，確定順序的正確性。
1945年，Sanger成功發展了蛋白質或胜肽的胺基末端決定方法。他使用2,4-二硝基氟苯(DNFB)與第一級胺基（以及支鏈的酚基、硫醇基、密唑基）以Schotten-Bauman方式反應。胺基末端的二硝基酚衍生物(DNP-胜肽)，在酸水解的情況下很穩定，胜肽衍生物完全水解後，DNP-胺基酸便釋放出來。
DNP-胺基酸可用諸如醚類的有機溶劑，從其餘的胺基酸中萃取出來。DNP-胺基酸的鑑定，是根據它與已知DNP-胺基酸的濾紙色層分析對照得知，DNP-胺基酸是黃色化合物，因此，其產量可在純樣品的鹼性溶液中，以360nm的波長作分光測量而估得。
雖然這種方法只限於胺基末端胺基酸的鑑定，但在蛋白質、胜肽及蛋白質的亞單位上，已足以獲得相當有用的資料。Sanger在胰島素分子的研究上，發現DNP-胰島素水解物中，有等量的DNP-glycine與DNP-phenylalanine。此事實指出胰島素分子有兩條聚肽鏈。
如果DNP-蛋白質（或DNP-胜肽）受到酸的水解，則會形成小DNP-胜肽及游離胺基酸的混合物。DNP-胜肽的組成可用來鑑定連接於胺基末端的胺基酸。例如，我們得知DNP-ala, DNP-ala (tyr), DNP-ala (tyr, ala)，便可明確地建立Ala-Tyr-Ala的順序。從DNP-胜肽的組成，可推斷四個到五個胺基酸的順序。
1963年，Stark與Smyth發表了一種新方法，用以決定胺基末端的胺基酸，這方法就是氰酸化法。溶於變性溶劑，如8M尿素或4M氰化胍中的蛋白質，以氰酸化鉀處理，使胺基定量轉變為胺基碳酸衍生物(carbamyl derivative)，然後將分離的胺基碳酸蛋白質作裂解，在高溫環境中與強酸短暫作用，此過程會水解出許多胜肽鍵，並把胺基末端胺基酸的胺基碳酸衍生物，轉變為環狀的hydantoin構造。 Amino acid hydantoin與游離的胺基酸不同之處，在於前者沒有帶電荷的取代物，利用此差異，透過離子交換色層分析法，可以很容易把hydantoin與胺基酸分離。分離得到的hydantoin再用6N HCl水解，又可復得胺基酸。復得的胺基酸可用胺基酸分析鑑定，其量可經由計算而知。與Sanger法不同的是，氰酸化法與胺基酸的復原有關，不用胺基酸衍生物，而直接測定胺基酸，這種方法的簡便性，使得氰酸化法的使用更加廣泛。
Edman發表了一種聚肽的順序切割法，這可能是目前蛋白質序列分析中，最重要的技術。末端胺基酸的移除，是經兩個步驟完成的。首先，胜肽在pH 8下，以異硫氰酸苯酯(phenylisothiocyanate)處理，使末端胺基酸轉變為硫胺基碳酸苯的衍生物(phynylthiocaibamyl derivate)(PTC-太胜)。第二步是PTC-胜肽用無水的三氟醋酸(trifluoroacetic acid)處理，催化末端胺基酸環化為Anilino-thiazolinone的衍生物。
五環的生成，是由於硫胺基酸上的硫原子，對第一個胜肽鍵上的羰基作親質性的攻擊，伴隨環狀封閉的，是第一個和第二個胺基酸間肽鍵的斷裂，在這種非水解狀況下，所有其他的肽鍵都保持完整。末端胺基酸的anilino-thiazolinone若用有機溶劑，可以從胜肽中萃取出來。胜肽中的胺基酸，如果有必要再進行切割，可重複地偶合和環化，直到所有的胺基酸都被移除。
以Edman切割法逐步移除的胺基酸都被鑑定後，聚肽胺基酸順序就被建立了。移除的胺基酸，可用環狀衍生物直接測定，或者用胜肽與殘留的胜肽間胺基酸組成的差異間接測定。
移除胺基酸的直接鑑定，是用phenyl thiohydantoin衍生物(PTH-胺基酸)，這種衍生物是anilino-thiazolinone胺基酸在酸催化下，重新排列而成的。
PTH-胺基酸可用濾紙或薄層色析法之類的分類色層分析法(partition chromatography)鑑定。在支持介質上以紫外輻射的吸光，以及發出螢光的能力而偵測出，並在265到270nm中，使用莫耳消光係數以估計其量。氣體色層分析和質譜儀，也可對PTH-胺基酸作定量分析。
直接鑑定PTH-胺基酸的好處是，它只耗用極少量的樣品，是相當靈敏的偵測系統。第二個好處是，色層分析系統能分辨glutamine和glutamic acid，以及asparagine和aspartic acid。在順序的指認中，Edman切割法對醯胺和其他酸性下不安定胺基酸的鑑定，是個很重要的方法，因為其他分析法都是使用酸性水解的樣品來完成。PTH-衍生物，在150℃下以6N HCl處理16小時，便能獲得原來的胺基酸，至於游離胺基酸的鑑定，可用胺基酸分析儀順利達成。
各切割步驟移除的胺基酸，也可用胺基酸分析儀加以鑑定；所鑑定的不是移除的部分，而是剩餘的部分。完整的胜肽和各切割步驟之後殘留的胜肽，所作的胺基酸分析，可以建立大致的胜肽序列。差別分析之利在於它使用胺基酸分析儀，因此，可以避免鑑定胺基酸衍生物的輔助步驟。其弊在於各胺基酸分析時，總胜肽的一部份被消耗，剩餘的胜肽量可能會不夠。
七、Dansyl-Edman步驟(Dansyl-Edman procedure)
Gray和Hartley發展了一種高靈敏的胺基末端尾基的方法，以控制Edman切割的進行，這種方法叫”dansyl”法。胜肽樣品分佈於一系列的試管中，一根試管對一胺基酸。對所有樣品作順序的Edman切割，一步驟之後，便移出一樣品以便作尾基分析。胜肽的順序，是從完整胜肽的胺基末端，與各切割之後的胜肽胺基酸間建立起來的。
胺基末端的分析是用氯化1-二甲基胺基柰-5-磺酸(1-dimethyl-aminonaphthalene-5-Sulfonyl chloride)(dansyl chloride, DNS-Cl)。此法類似Sanger的DNFB法，DNS-Cl與胜肽反應，生成對酸穩定的游離胺基酸磺酸醯胺衍生物(sulfonamide derivative)。
DNS-胜肽用6N HCl水解生成游離胺基酸，和胺基末端胺基酸的磺酸醯胺衍生物，胺基酸衍生物再用濾紙電泳法或薄層色層分析法。Dansyl胺基酸用紫外線照射，出現螢光點而偵測出來，偵測的範圍在10-4到10-5微莫耳，所以Edman分析步驟的靈敏度，高達5到10的10-9莫耳的胜肽樣品。
八、蛋白質胜肽定序儀(Protein peptide sequenator)
蛋白質定序儀，是為了自動分析蛋白質和大段胜肽鍊的異硫氰酸苯酯衍生物而設計的。儀器的決定性部分是反應管的設計與操作，這種反應管是置於溫度控制玻璃室內的旋轉玻璃杯內。樣品導入杯的底部，離心力使樣品以薄膜分佈於邊緣。表面積的增大，增加了反應的效率和數個所需的萃取步驟，並減少下一個步驟前乾燥樣品所需的時間，離心力則有助於萃取。每個切割步驟之後，anilino-thiazolinone衍生物被萃取出來，運送到部分收集器，以便將來作為分析之用。
定序儀有一儲存單位，內含切割所需的溶液和溶劑，自動操作器把適當的液體系統連接到反應杯中，程式算準所有操作的時間，並控制樣品完全切割的順序。
九、Aminopeptidase的水解(Hydrolysis with aminopeptidases)
胜肽用leucine aminopeptidase或aminopeptidaseM部分水解，所釋出的胺基酸作動力分析，便可推斷出胜肽部分順序。這些酵素能催化胺基末端胜肽鍵的水解，並釋出游離的胺基酸，水解由一胺基酸到另一胺基酸依序進行。
這兩種酶已從豬的腎臟中純化出來：leucine aminopeptidase連接細胞可溶的部分，而aminopeptidaseM為顆粒狀酶，位於細胞的微粒體(microsome)部分。這兩種酶都可購得，適合胜肽有限的切割，但是特異性卻略有不同。脂肪族和芳香族胺基酸水解得很快，其他則水解得較慢，差別在數級大小的範圍上。
Aminopeptidase M催化所有肽鍵的水解，而leucine aminopeptidase則除了proline的亞胺基外，皆可催化水解。結果，用leucine aminopeptidase水解胜肽，將移除胺基末端旁為亞胺鍵的所有胺基酸，因此，所得胜肽的順序起使於X-Pro，”X”為通常的胺基酸。Prolidase能水解-X-Pro的連接，如果剩餘的胺基酸欲釋出，則必須加入leucine aminopeptidase。
Aminopeptidase限制性地切割胜肽，除了提供部分順序外，胺基酸的釋出，也給酸性下不安定胺基酸，asparagine、glutamine 、tryptophan的位置，供給有價值的情報。因為這些胺基酸完整地被釋出，這種直接的鑑定，較完整胜肽（醯胺類或酸基）的電泳移動或tryptophan的分光測量分析的間接認定，更為可靠。
十、羧基末端方法(Carboxyl-terminal methods)
最常用作蛋白質的羧基末端的化學鑑定法，就是井分解(hydrazindysis)。樣品溶於無水的井化物(hydrazide)，混合物在一百度下保持二十小時。羧基末端胺基酸便以游離胺基酸釋出；所有其他蛋白質中的胺基酸，都以強鹼性胺基酸井化物存在。羧基末端胺基酸可用Sanger的DNP法，或離子交換色層分析法，與井化物分離。末端胺基酸利用胺基酸分析儀而鑑定，回收率很低，產量還隨蛋白質而異，反應的最佳狀況很難尋得。甚至胺基酸井化物進行甚緩的水解被破壞，因而增加游離胺基酸的含量。
羧基末端胺基酸的醯胺位於支鏈(asparagines or glutamine)或位於α-羧基位置者，也可形成井化物。如果這反應發生，則不生成游離的胺基酸，相反的，以井化物出現。如果是這樣，則井化物必須分離而鑑定，否則井分解法將失敗。井化物與arginine的胍基反應甚慢，部分轉變成ornithine因而增加了建立羧基末端胺基酸arginine的困難性。井分解法的成功需要定量地把胺基酸轉變為井化物，即使是低程度的水解也要避免。過量的井有助於反應的完成，無水狀況也可消除水解。
十一、Carboxypeptidase的水解(Hydrolysis with carboxypeptidases)
蛋白質或胜肽用胰臟的carboxypeptidase處理後，羧基末端的胺基酸便可選擇性地釋出。羧基末端所釋放的胺基酸能補助leucine aminopeptidase所獲得的順序情報，後者由胺基末端釋放胺基酸。
兩種carboxypeptidase已從牛的胰臟特化出來：首先發現者為carboxypeptidase A，第二個為carboxypeptidase B。Carboxypeptidase A催化許多羧基末端胺基酸肽鍵水解，不過，對芳香族胺基酸的水解最快；其他胺基酸也可水解，但是相對速率的差別卻很大。Carboxypeptidase A不能釋放proline, lysine and arginine。當可水解的胺基酸位於羧基末端和鄰近位置，酶可依序地釋出胺基酸。各胺基酸的相對產量必須與時間配合，才能推論正確的順序。
Carboxypeptidase B僅能水解末端胺基酸為lysine和arginine的蛋白質，如果此二者之一位於羧基末端，則連接的肽鍵被水解，因而釋出鹼性胺基酸。
如果carboxypeptidase A存在，則新的羧基末端胺基酸，可因此釋放。胰蛋白酶分解的胜肽，必須使用這兩種酶，以便順序地釋出胺基酸，因為胰蛋白酶分解的胜肽終止於鹼性胺基酸。
※參考資料: 王立禾, 阮立昂譯 蛋白質構造與功能 P107~121 復漢出版社 (1977)
整理: 黃信明
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