蛋白質定量法

一、原理

二、儀器與材料

三、步驟

四、補充

  I.UV 吸光法(Utraviolet Absorption Method)

  II.Biuret 法:

  III.Lowry法(Folin reagent 法)

這個部份我們以Bradford protein–binding assay實驗，來說明如何定量蛋白質。

一、原理

以Bradford protein–binding assay 的方法進行蛋白質定量，此定量方法利用Coomassie Brilliant Blue G-250會與蛋白質結合的特性，在G-250與蛋白質結合後，G-250的顏色會從紅色轉變成為藍色，此時在595 nm波長下，會有較高的吸收，以便偵測。這個方法的優點為G-250與蛋白質結合所需的時間很短(大約2分鐘左右)，且結合的G-250-蛋白質複合物(complex)可在溶液中維持較長的時間(大約1小時)。此法方便而靈敏(10 ng 左右)，且可使用微量滴定盤進行分析，可減低試劑用量，方便大量樣本的操作。

二、儀器與材料

10 mM citric acid-sodium citrate buffer, pH 5 (10 mM citric acid及10 mM sodium citrate)

Bovine serum albumin (BSA, Sigma A2153): standard protein solution, 100 mg/ml

Bio-Rad Dye Reagent (Bio-Rad, 500-0006): 1/4 dilution water

Microtiter plate (Nunc, 442404)

Micro test tubes, pin or torch flame

三、步驟

1.    備製BSA標準溶液，並混合均勻

2.    備製樣本溶液：

(1)   Blank ：500 ml 10 mM citric acid-sodium citrate buffer

(2)   原酵素抽取溶液： 500 ml 抽取的酵素溶液

(3)   1/2倍稀釋之酵素抽取溶液：取250 ml 抽取的酵素溶液加入250 ml 10 mM citric acid-sodium citrate buffer，混合均勻。

3.    各取50 ml 備製好的標準溶液及樣本溶液加入ELISA plate 中，並重複二次。

4.    每個well 中加入

  (1)200 ml diluted Bio-Rad Dye Reagent Diluted Regagent 的配置:

    以4倍的去離子水加1倍 Bio-Rad Dye Reagent稀釋，並混合均勻，

    此稀釋液可在室溫下使用2星期。

  (2)15 ml undiluted Bio-Rad Dye Reagent.

    所使用 Dye Reagent的濃度及用量視抽取樣本中的蛋白質濃度而    

    定，標本濃度高用(1) ，而濃度低用(2) ，Reagent 加入後溫和地輕

    敲plate邊緣。注意：避免氣泡產生。

5.    於室溫下靜置10 分鐘後，標準溶液以label 0 作為blank，樣本溶液以B作為blank，於ELISA reader 測595 nm吸光值。

6.    紀錄ELISA reader 測得的595 nm吸光值。並依據BSA標準濃度及其吸光值繪製標準曲線圖。

7.      依據BSA標準濃度及其吸光值繪製標準曲線圖。

8.      依據標準曲線圖估計樣品之蛋白質濃度（mg/ml）。

四、補充

1. 目前所使用試劑可直接向業者購買，再依業者提供的使用步驟進行。若要自行配製試劑，可以下列步驟進行蛋白質定量：

(1)取2 ml待測之樣品，加水至500 ml。

(2)加入500 ml蛋白質分析反應劑（protein assay reagent），混合均勻。

(4)   靜置5分鐘後，測其595 nm波長之吸光值。（Blank 為取2 ml緩衝液，加水至500 ml，加入500 ml蛋白質分析反應劑）。

材料:

1.蛋白質分析反應劑：0.01%(w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250，4.7% (w/v) ethanol及 8.5%(w/v) phosphoric acid。

2. 蛋白質定量的方法除利用Bradford protein-binding assay之外，還有其他定量方法：

I.        UV 吸光法(Utraviolet Absorption Method)

一般有機物質，對於波長在250 nm 以下的光才有吸收作用，但含有苯環的胺基酸(aromatic amino acids)，對於波長250 nm 以上的光卻有吸收作用。

凡含有此等胺基酸的蛋白質，其水溶液對於波長在260 nm至290 nm (通常取280 nm波長)之光，均有吸收作用，其吸收量與蛋白質溶液的濃度成正比。所以含有phenylalanine、tyrosine或tryptophan的蛋白質，均可採用此法來定量。不過，本法易受對於280 nm附近的光也有吸收作用的其他化學物質的干擾。核酸對於260 nm的光有很大的吸收作用，而對280 nm 的光吸收作用僅及前者1/10，在生物體中，蛋白質常與核酸結合在一起，故蛋白質之定量宜作下列修正：蛋白質溶液概約濃度(mg/ml) = 1.45 A₂₈₀ – 0.74 A₂₆₀。胺基酸的aromatic group在280 nm 有吸光，蛋白質peptide bond骨架上的基團在200 nm 附近有吸光。由於各種蛋白質所含aromatic amino acids組成不一，它們在280 nm 的吸光值能力亦不同。

II.           Biuret 法:

Biuret試劑乃鹼性硫酸銅溶液，銅離子在鹼性溶液中，會與蛋白質上的peptide bonds結合，生成藍色或紫色的複合物(Biuret, NH₂CONHCONH₂)，由於biuret是在鹼性環境中和CuSO4發生呈色反應之最小單位，故此反應稱biuret試驗。其反應式如下:

Biuret方法的靈敏度(sensitivity)較差(10 mg 左右)，會受樣品中某些化合物所干擾，例如：硫酸銨、Tris、Ammonia及Glycerol，若是修正一些實驗步驟來排除這些干擾，通常會花費較多的時間且實驗步驟會變得較複雜。Biured 方法準確度較高，不受蛋白質的種類影響。其顏色的深淺與peptide bonds的數目成正比，故由之可決定蛋白質的量。一般言之，蛋白質分子越小，經此反應後所呈之色越粉紅，故反應後，分子量較小的蛋白peptone呈粉紅色，而分子量較大的卵蛋白(albumin) 則呈藍紫色。

本反應只對含有三個或三個以上peptide bonds的蛋白質有反應，而對只含有一個peptide bond的雙胜鈦(dipeptide)及不含peptide bond的氨基酸(serine及threonine除外)，則無此反應。

III.   Lowry法(Folin reagent 法)

是Biuret法的延伸。銅離子在鹼性溶液中，與peptide bonds形成複合物後，可進一步的將Folin reagent 內的phosphomolybdic-phospho- tungstate 還原而使溶液變為藍色，在波長660 nm有很強的吸光，故測定OD₆₆₀，並與已知濃度之蛋白質比較，換算出待測液中蛋白質含量。由於本法所呈現的顏色較Biuret 方法為深，因此靈敏度較Biuret方法為佳(可測至約0.1 mg)，本方法也會受硫酸銨、鉀離子、鎂離子、EDTA、Tris、硫醇化合物(thiol reagent)以及碳水化合物的干擾。

蛋白質在溶液中，和Folin reagent所生之呈色反應，可分為兩個階段：

1.      加入alkaline copper reagent (2% Na₂CO₃, 0.1 N NaOH, 0.01% CuSO₄．5H₂O, 0.02% sodium potassium taratrate)，蛋白質溶液先在鹼性溶液中，先和銅離子發生反應：

Cu²⁺ + Protein^-  ↔  Cu – Protein

此段反應可能與Biuret反應相似。Lowery 及其共同研究者，曾求得第一階段的視解離常數(Apparent dissociation constant)

K_app = [Cu²⁺][Protein^-]/[ Cu – Protein]

在[Cu²⁺] 低時K = 3´10^-6 mole/L

2.      然後加入Folin reagent (為酸性溶液，含有10% (g/v) sodium tungstate (Na₂WO₄.2H₂O), 2.5% (g/v) sodium molybdate (Na₂MoO₄. 2H₂O,由 4.3% phosphoric acid)，蛋白質內含有苯環的胺基酸(aromatic amino acids)在銅離子的催化下，可將Folin reagent中的phosphomolybdic-phospho-tungstic acid還原成heterpolymoly- bdenum blue，進一步使得溶液的顏色變為較深的藍色。

此試劑的還原發生於pH = 10 ~ 10.5時，呈色效果最好(即所呈之色最深)，不過，在此pH 下此試劑不安定，經過一段時間就會喪失其還原能力，則其反應力隨試劑中磷鉬酸根(phosphomolybdate)的原有黃色的消失而降低。

磷鉬酸根(phosphomolybdate)黃色的消失，係因此等陰離子(anion)發生解離所造成的。欲使本試劑有最大的呈色效果，宜使用pH 值近於10 的緩衝溶液，使其還原作用在此種緩衝溶液中進行。若蛋白質中兩個tyrosine residues 相距過近，則會降低其靈敏度，因此本法之靈敏度，受蛋白質分子中的tyrosine residues 數量及tyrosine residues 之排列間隔支配。又若蛋白質中不含aromatic amino acids，則不與本試劑起呈色反應，而不能使用本法定量。但一般說來，絕大部分的蛋白質都含有aromatic amino acids，故本法在酵素化學上最為常用。

IV.        Bicinchoninc acid procedure (BCA)

BCA法與Lowry法相似，主要差別在鹼性溶液中，蛋白質使銅離子由二價轉變成一價後，進一步的以BCA 取代Folin reagent與一價銅離子結合產生很深的紫色，在波長562 nm有很強的吸光。本法的優點在於鹼性溶液中BCA 比Folin reagent穩定，因此BCA與鹼性銅離子溶液結合的呈色反應只需一步驟即完成。本法的靈敏度Lowry法相似(可測至約0.1-1.2 mg protein/ml)，以微量分析(microassay) 靈敏度可測至約0.5-10 mg protein/ml。本方法對於陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑(anionic, non-ionic, zwitterionic)、guanidine-HCl和尿素較具容忍度，較不受干擾，但也會受還原糖(reducing sugars) 及EDTA的干擾。

藥品配製：

1. Protein solutions were prepared in 0.15 M NaCl

2. 10 mM Na-citrate , pH 5緩衝液(10 mM citric acid及10 mM sodium citrate)

(1)    配1 M citric acid 500 ml: 取105.07 g citric acid (MW= 210.14)，加入400 ml 二次水使其溶解後，將體積補至500 ml。

(2)    配1 M sodium citrate 500 ml: 取147.05 g sodium citrate (MW= 294.1) ，加入400 ml 二次水使其溶解後，將體積補至500 ml。

(3)    將1 M citric acid及1M sodium citrate分別稀釋為10 mM後，取1000 ml 10 mM sodium citrate於2 L錐型瓶中，再加入1000 ml 10 mM citrate acid 混合後，以pH meter 測定溶液酸鹼值，若低於pH 5 則加10 mM sodium citrate，若高於pH 5 則加10 mM citrate acid，直到pH值為5。

3. 100 mg/ml BSA: 取2 mg bovine albumin於錐形瓶中加入20 ml二次水，混合至完全溶解。

4. 蛋白質分析反應劑(Protein assay reagent) (0.01%(w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250, 4.7% (w/v) ethanol, and 8.5%(w/v) phosphoric acid)：

取0.1 g 之Coomassie Brilliant Blue G-250 (100mg；Sigma)溶於50 ml 95% 酒精中，完全溶解後加入100 ml之85%(w/v) phosphoric acid，最後將總體積以二次水補至一升。