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膠體電泳
帶電顆粒在電場作用下，向著與其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis, EP)。早在1808年就發現電泳現象，但作為一種分離方法，卻是在1937年。瑞典科學家Tiselius設計了世界上第一台自由電泳儀，建立了”移界電泳法(moving boundary EP)”，成功地將血清蛋白質分成白蛋白(albumin)，α1-,α2-, β-和γ-球蛋白(globulin)五個主要成分，為人們瞭解血清奠定了基礎。由於他的突出貢獻，1948年獲得諾貝爾獎。
由於”移界電泳法”電泳時自由溶液受熱後發生密度變化，產生對流，使區帶擾亂，加之Tiselius電泳儀價格昂貴，不利於推廣，所以到了50年代，許多科學家著手改進電泳儀，尋找合適的電泳支持介質，先後找到濾紙、醋酸纖維生素薄膜、澱粉及瓊脂醣做為支持物。60年代，Davis等科學家利用聚丙烯醯胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎上發展了SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉移電泳等技術。這些技術具有設備簡單，操作方便，分辨率高等優點。分離後的物質可進行染色，紫外吸收、放射顯影、生物活性測定等，從而取得定量數據。目前，電泳技術已成為生物化學、免疫學、分子生物學以及與其密切相關的醫學、農、林、牧、魚、製藥、某些工業分析中不可或缺的實驗方法。特別是80年代以來，生物工程作為技術革命的標誌之一，許多研究的重要環節都要依賴各種類型的電泳分離技術解決。因此，電泳技術必然會在基礎生物科學的研究中，在國民經濟的發展中以及在醫療保健事業的發展中發揮巨大的作用。
任何物質由於本身的解離作用，或表面上吸附其他帶電質點，在電場中便會向一定的電極移動。作為帶電顆粒可以是小的離子，也可是生物大分子、蛋白質、核酸、病毒顆粒、胞器等。因蛋白質分子是由胺基酸組成，而胺基酸帶有可解離的胺基(-N+H3)和羧基(-COO-)，是典型的兩性電解質，在一定的pH條件下會解離而帶電。帶電的性質和多少取決於蛋白質分子的性質及溶液的pH值、離子強度。在某一pH條件下，蛋白質分子所帶的正電荷恰巧等於負電荷數，即靜電荷等於零，此時蛋白質質點在電場中不移動，溶液的這一pH值稱為該蛋白質的等電點(pI)。如果溶液的pH值大於pI，則蛋白質分子會解離出氫離而帶負電，此時蛋白質分子在電場中正極移動。如果溶液的pH值小於pI，則蛋白質分子結合一部份氫離子而帶正電，此時蛋白質分子在電場中向負極移動。
電場強度是指每釐米的電位梯度（電勢梯度）。電場強度對泳動速度起著重要的功用。電場強度愈高，則帶電顆粒泳動越快。例如濾紙電泳時，在濾紙二端相距25 cm處測得電位降為250V，則電場強度為250/25＝10V/cm。根據電場強度的不同，濾紙電泳可分為： (1) 常壓(100-500V)電泳。其電場強度為2-10V/cm，分離時間較長，從數小時到數天，適合分離蛋白質等大分子物質。 (2) 高壓(2000-10000V)電泳。其電場強度為50-200V/cm，電泳時間很短，有時只需幾分鐘。多用於分離胺基酸、核甘酸、醣類等小分子物質。
為使電泳時pH恆定，必須採用緩衝液作為電極緩衝液，溶液的pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。對蛋白質而言，溶液pH值離等電點(pI)越遠，則顆粒所帶的淨電荷越多，泳動速度也月快；反之，則越慢。因此分離某種蛋白質混合液時，應選擇一個合適的pH，使欲分離的各種蛋白質所帶的電荷數量有較大的差異，更有利於彼此的分開。
液體在電場中，對於一個固體支持物的相對移動，稱為電滲(electrosmosis)現象。。例如濾紙電泳，由於濾紙上吸附OH-離子帶負電荷，而與紙相接觸的水溶液帶正電荷，液體便會向負極移動，並攜帶顆粒同時移動。所以電泳時，顆粒泳動的表面速度、顆粒本身的泳動速度，等於電滲攜帶顆粒的移動速度之和。若顆粒原來向負極移動，則其表觀速度將比泳動速度快；若原來向正極移動，則其表面速度(apparent velocity)將比泳動速度慢。為校正這一誤差，可用中性物質糊精(dextrin)、蔗糖或葡萄糖(dextran)等與樣品同時做濾紙電泳，然後將其移動距離自實驗結果中除去。
一般要求支持物均勻、吸附力小，否則電場強度不均勻，影響區帶的分離，實驗結果及掃瞄圖譜均無法重複。如濾紙電泳時，濾紙厚薄不均勻或吸附力過大，則蛋白質或其他膠體顆粒在他們泳動過程中有一部份被濾紙吸附，造成分離區帶蛋白質含量相對量降低。因此，電泳前應事先處理濾紙，以減少濾紙的吸附能力，可取得較好的分離效果。
電泳過程中由於通電產生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度升高時，介質黏度下降，分子運動加劇，引起自由擴散變快，遷移率增加。溫度每升高一度，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，也可在電泳系統中安裝冷卻散熱裝置。
可分為區帶電泳、移界電泳、等速電泳和聚焦電泳。 (1) 區帶電泳 電泳過程中，不同的離子成分在均一的緩衝液體中分離成獨立的區帶，這是當前應用最廣泛的電泳技術。 (2) 移界電泳 是Tiselius最早建立的電泳，它是在U型管中進行的，由於分離效果較差，已為其他電泳技術所取代。 (3) 等速電泳 需專用電泳儀，當電泳達到平衡後，各區帶相隨分成清晰的界面，並以等速移動。 (4) 等電聚焦 由於具有不同等電點的兩性電解質載體在電場中，自動形成pH梯度，使被分離物移動至各自等電點的pH處聚集形成很窄的區帶，且分辨率較高。
根據電泳是溶液還是在固體支持物中進行，可分為以下兩種： (1) 自由電泳 可分為：(1)顯微電泳（也稱細胞電泳），是在顯微鏡下觀察細胞或細菌的電泳行為；(2)移界電泳；(3)柱電泳，是在層析柱中進行，可利用密度梯度的差別，使分離的區帶不再混合，如再配合pH梯度則為等電聚焦柱電泳；(4)自由流動幕電泳；(5)等速電泳等。
(2) 支持物電泳 其支持物是多種多樣的，也是目前應用最多的一種方法。其電泳過程可以是連續的或是不連續的可進行常壓電泳、高壓電泳、免疫電泳、等電聚焦電泳及等速電泳。根據支持物的特點又可分為：
* 無阻滯支持物，如濾紙、醋酸纖維薄膜、纖維素粉、澱粉、玻璃粉、聚醯胺粉末、凝膠顆粒等。 * 高密度的凝膠，如澱粉凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂或瓊脂醣凝膠。 電泳槽的形式也是多種多樣的，有垂直的、水平的、柱狀的、毛細管的。
聚丙烯醯胺凝膠是由單體(monomer)丙烯醯胺(acrylamide, Acr)和交聯劑(crosslinker)又稱為共聚體的N，N-甲叉雙丙烯醯胺(methylene-bisacrylamide, Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯成三維網狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)。與其他凝膠相比，聚丙烯醯胺凝膠有下列優點：
(1) 在一定濃度時，凝膠透明、有彈性、機械效能好。 (2) 化學性能穩定，與被分離物不起化學作用。 (3) 對pH和溫度變化較穩定 (4) 幾乎無電滲作用，只要純度高，操作條件一致，樣品分離重複性好。 (5) 樣品不易擴散，且用量少，靈敏度可達1ug。 (6) 凝膠孔徑可調節，根據被分離物的分子亮選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑。 (7) 分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體，因而叫醋酸纖維素薄膜電泳、瓊脂醣電泳等有更高的分辨率。
PAGE應用範圍廣，可測定蛋白質、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量極少量的製備，還可測定分子量、等電點等。
聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)根據其有無濃縮效應，分為連續系統與不連續系統兩大類，前者電泳體系中緩衝液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應；後者電泳體系中由於緩衝液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中流動不僅有電荷效應、分子篩效應、還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度和分辨率均較前者佳。
目前常用的多為垂直的圓盤及版狀兩種。前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區帶染色後成圓盤狀，因而稱為圓盤電泳(disc electrophoresis)；後者，凝膠是在二塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，稱為板狀電泳(slab electrophoresis)。兩者電泳原理完全相同。不連續體系由電極緩衝液、樣品膠、濃縮膠及分離膠所組成，他們在直立的玻璃管中（或二層玻璃板中）排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。
樣品膠是核黃素催化聚合而成的大孔膠，T=3%, c=2%，其中含有一定量的樣品及pH 6.7的Tris-HCl凝膠緩衝液，其作用是防止對流，促使樣品濃縮以免被電極緩衝液稀釋。目前，一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40％蔗糖，同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用。
實際上，濃縮膠是樣品膠的延續，凝膠濃度及pH值與養品交完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的扁盤，從而提高分離效果。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，T=7.0-7.5%, c=2.5%，凝膠緩衝液為pH 8.9 Tris-HCl，大部分血清中各種蛋白質在此pH條件下，按各自負電荷量及分子量泳動。此膠主要起分子篩作用。
上，下電泳槽是用聚苯乙烯或二甲基丙西酸製作的，將帶有3層凝膠的玻璃管垂直放在電泳槽中，在兩個電極槽中倒入足夠量pH 8.3 Tris-甘胺酸電極緩衝液，接通電源即可進行電泳。在此電泳體系中，有2種孔徑的凝膠、2種緩衝體系、3種pH，因而形成了凝膠孔徑、pH、緩衝液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。PAGE具有較高的分辨率，就是因為在電泳體系中及樣品濃縮效應、分子篩效應及電荷效應為一體。下面就這三種物理效應的原理，分別加以說明。
(1) 凝膠孔徑不連續性：在上述3層凝膠中，樣品膠及濃度膠T=3%為大孔膠；分離膠T=7%或7.5%為小孔膠。在電場作用下，蛋白質顆粒在大孔膠中泳動所遇到的阻力小，移動速度快；當進入小孔膠時，蛋白質顆粒泳動受到的阻力大，移動速度減慢。因而在二層凝膠交接處，由於凝膠恐徑的不連續姓使樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區帶。
(2) 緩衝體系離子成分及pH值的不連續性：在3層凝膠中均有三羥甲基胺基甲浣(Tris)及HCl。Tris的作用是維持溶液的電中性及pH，是緩衝配對離子。HCl在任何pH溶液中均亦解離出氯離子，其在電場中遷移率快，走在最前面稱為前導離子(leading ion)或快離子。在電極緩衝液中，除有Tris外，還有glycine，pK1=2.34, pK2=9.4, pI=(pK1+pK2)/2=6.0，它在pH 8.3的電極緩衝液中，易解離出甘胺酸根(NH2CH2COO-)，而在pH 6.7的凝膠緩衝體系中，甘胺酸解離度最小，僅有1-0.1%，因而在電場中遷移很慢，稱為尾隨離子(trailing ion)或慢離子。血清中，大多數蛋白質pI在5.0左右，在pH 6.7或8.3時均帶負電荷，在電場中，都向正極移動，其有效遷移率（有效遷移率=mα，m為遷移率，α為解離度）介於快離子與慢離子之間，於是蛋白質就在快、慢離子形成的界面處，被濃縮成為極窄的區帶。他們的有效遷移率按下列順序排列：mclαc1>mpαp>mGαG（Cl代表氯離子，P代表蛋白質，G代表甘胺酸根）。
若為有色樣品，則可在界面處看到有色的極窄區段帶。當進入pH 8.9的分離膠時，甘胺酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質；因此Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續前進。蛋白質分子由於分子量大，被留在後面，然後在分成多個區帶。因此，濃縮膠與分離膠之間pH的不連續性，是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。在樣品膠和濃縮膠中，要求慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低，以使樣品夾在快、慢離子界面之間被濃縮。進入分離膠後，慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響。
(3) 電位梯度的不連續性：電位梯度的高低與電泳速度的快慢有關，因為電泳速度(v)等於電位梯度(E)與遷移率(m)的乘積(v=Me)。遷移率低的離子，在高電位梯度中，可以與具有高遷移率而處於低電位梯度的離子具有相似的速度。在不連續系統中，電位梯度的差異是自動形成的。電泳開始後，由於快離子的遷移率最大，就會很快超過蛋白質，因此在快離子後面，形成一個離子濃度低的區域即低導電區。因為E=I/η（E為禱電梯度，I為電流強度，η為導電率）。E與η成反比，所以低電導區就有了較高的電位梯度。這種高電位梯度使蛋白質和慢離子在快離子後面加速移動。當快離子、慢離子和蛋白質的遷移率與電位梯度的乘積彼此相等時，則三種離子移動速度相同。在快離子和慢離子的移動速度相等的穩定狀態建立之後，則在快離子和慢離子之間形成一個穩定而又不斷向陽極移動的界面。也就是說，在高電位梯度和低電位梯度之間的地方，形成一個迅速移動的界面。由於蛋白值的有效遷移率恰好介於快、慢離子之間，因此也就聚焦在這個移動的界面附近，被濃縮形成一個狹小的中間層。
分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率，這就是分子篩效應。經上述濃縮效應後，快、慢離子及蛋白質均進入pH 8.9的同一孔徑的分離膠中。此時，高電壓消失，在均一的電壓梯度下，由於甘胺酸解離度增加，加之其分子量小，則有效泳動率增加，趕上並超過各種血清蛋白質。因此，各種血清蛋白質進入同一孔徑的小孔膠時，詞分子遷移速度與分子量大小和形狀與其遷移率密切相關，分子量小且為球形的蛋白質所受阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在後面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質分成各自的區帶。這種分子篩效應不同於管柱層析中的分子篩效應，後者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子後流出。
雖然各種血清蛋白質在濃縮膠與分離膠界面處被高度濃縮，形成一狹窄的高濃度蛋白質區，但進入pH 8.9的分離膠中，各種血清蛋白質所帶淨電荷不同，而有不同的遷移率。表面電荷多，則遷移率快；反之，則慢。因此，各種蛋白質按電荷多少、分子量及形狀也一定順序排成一個個圓盤狀的區帶，因而稱為圓盤電泳。
目前，PAGE連續體系應用也很廣，雖然電泳過程中無濃縮效應，但利用分子篩及電荷效應也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質、核酸、酵素等活性物質變性失活，也顯示了他的優越性。
聚丙烯醯胺垂直電泳是在圓盤電泳的基礎上建立的，兩者電泳原理完全相同，只是灌膠的方式不同，凝膠不是灌在玻璃管中而是灌在嵌入橡皮框凹槽中長度不同的兩塊平行玻璃板的間隙內。且間隙可調節，一般有0.5mm, 1.5mm, 3mm三種規格的橡膠框，前二者多用於分析鑑定，後一種常用於製備。垂直電泳較圓盤電泳有更多優越性：
(1) 表面積大而薄，便於通冷卻水以降低熱效應，條帶更清晰。 (2) 在同一塊膠板上，可同時進行10個以上樣品的電泳，便於在同一條件下比較分析鑑定，還可用於印跡轉移電泳及放射自顯影。 (3) 膠板製作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用於分離還可用於製備。 (4) 膠板薄而透明，電泳染色後可製成乾板，便於長期保存和掃瞄。 (5) 可進行雙向電泳。
血清蛋白質在濾紙或醋酸纖維素薄膜電泳中，只能分離出5-6條區帶，而上述兩種型式的聚丙烯醯胺卻可分離出數十條區帶，因而，目前PAGE已廣泛用於科學研究、農、醫及臨床診斷的分析、製備，如蛋白質、核酸、血清蛋白質、脂蛋白的分離及病毒、細菌提取液的分離。
雙向PAGE電泳是由兩種類型的PAGE組合而成。樣品經地一向電泳分離後，再以垂直它的方向進行第二向電泳。如這二向電泳體系pH及凝膠濃度完全相同，則電泳後樣品中不同成分的斑點基本上呈對角線分佈，對提高分辨率作用不大。1975年，O’Farrell等人根據不同生物分子間等電點及分子量不同的特點，建立了以第一向為IEF-PAGE，第二向為SDS-PAGE的雙向分離技術，簡稱為IEF/SDS-PAGE；或者第一向為IEF-PAGE，第二向為PG-PAGE，簡稱為IEF/PG-PAGE。最近又發展為微型IEF/PG-PAGE。他們的基本原理與IEF-PAGE、SDS-PAGE及PG-PAGE完全相同，只是操作方法與單向電泳完全不同。分別討論如下：
這種雙向電泳首先利用樣品中不同成分pI差異，進行IEF-PAGE第一向分離，然後縱向切割再以垂直於第一向的方向進行第二向SDS-PAGE，從而使不同分子量的蛋白質進一步分離。這是兩種不同的電泳體系，為保證第二向 SDS-PAGE能順利進行，在第一向IEF電泳體系中，必須加入高濃度尿素及非離子去污劑NP-40。在樣品溶解液中，除含有上述試劑外，還需加入一定量的雙硫蘇醣醇(dithiothreitol, DTT)。由於上述3種試劑本身不帶電荷，因此不影響樣品原有的電荷及pI值，其主要作用是破壞蛋白質分子內的雙硫鍵，使蛋白質變性及peptide鍊舒展，有利於蛋白質分子電泳後能在溫和的條件下與SDS充分結合，形成SDS-蛋白質複合物。
一般第一向IEF-PAGE是在凝膠柱或平板中進行；而第二向SDS-PAGE為垂直板型。由於凝膠柱直徑大於第二項凝膠厚度，因此，第一向電泳後凝膠柱需修切，以適應第二向凝膠版厚度，一般將原柱縱切二半，一半用於染色及測定pI；另一半用於第二向SDS-PAGE。如第一向為平板狀凝膠，則與電泳同方向縱切成窄條，在進行第二向電泳。由於這二項電泳體系組成成分及pH值不同，因此第一向電泳後應將窄條狀膠片放在第二向電泳緩衝液中震盪平衡約30 min，其目的是驅除第一向凝膠體系中的尿素、NP-40及兩性電解質載體，使第二向緩衝體系中的β-巰基乙醇可使蛋白質內的雙硫鍵保持還原狀態，更有利於SDS與蛋白質結合形成SDS-蛋白質複合物。
經平衡後的膠條進行下行電泳，則將其橫放在已製好的SDS垂直凝膠板的上部，長、短玻璃板間的縫隙內。然後再用濃縮膠或用緩衝液配置的1%熱瓊脂醣，加在波板上方開口處待聚合或凝固後，即將膠條封閉固定。如為上行電泳，則將凝膠條橫放在凝膠模兩塊玻璃板的縫隙下端，然後分別加入濃縮膠及分離膠。待凝膠聚合後，加入電極緩衝液即可進行電泳。因此，進行第二向SDS-PAGE時，樣品的處理與加熱方式使單向SDS-PAGE完全不同。IEF/SDS-PAGE染色，pI及分子量測定與IEF-PAGE，SDS-PAGE單向電泳完全相同。
目前，已有5000餘種蛋白質成分採用IEF/SDS-PAGE得到很好的分離，其高度分辨率是各種類型單向PAGE及其他雙向PAGE所無法比擬的。因此，IEF/SDS-PAGE雙向電泳已成為當前分子生物學領域內常用的實驗技術，可廣泛用於生物大分子如蛋白質與核酸酶解片段及核醣體蛋白質的分離和精細分析。隨著該技術的不斷改進及發展，其應用範圍將更加廣泛。
然而，此技術對某些鹼性蛋白質的分離確有其侷限性，因在第一向IEF-PAGE電泳體系中，含有高濃度的尿素，他的存在會使鹼性區的pH梯度變得很窄而且不穩定，可使鹼性蛋白質難以進入凝膠中或者易泳出凝膠外。因此，對鹼性蛋白質的分離分析應採用其他方法。
這種電泳第一向為IEF-PAGE，第二向PG-PAGE。其分離原理與單向IEF-PAGE及PG-PAGE相同，主要是利用蛋白質pI差異及凝膠孔徑逐漸變小的分子篩效應、以相互垂直的雙向電泳來提高分辨率。在第一向電泳中，蛋白質電荷密度高則遷移快，反之則慢。在第二向電泳中，由於蛋白質分子量大小不同，在孔徑梯度凝膠中，分子量愈大，遷移愈慢。當其遷移率受到凝膠孔徑阻力大到停止前進時，低電荷密度蛋白質成分將趕上與其大小相似高電荷密度的蛋白質成分，因此，第二向蛋白質成分的遷移主要取決於分子大小與凝膠的分子篩效應。
在IEF-PAGE第一向緩衝體系及樣品溶解液中，不含尿素、非離子去污劑NP-40、雙硫蘇醣醇等蛋白質變性劑，因此蛋白質樣品保持了原有的天然構象及生物活性。由於第一向無蛋白質變性劑，電泳後凝膠柱不需經過第二向電泳緩衝液震盪平衡，只需縱向切割就可橫放在已聚合的孔徑梯度凝膠膠面上，經封閉固定，即可進行第二向PG-PAGE，存在於第一向凝膠中的兩性電解質載體在第二向電泳過程中很快消失，從而使凝膠條內的環境與第二向電極緩衝液保持一致。
在IEF/PG-PAGE的基礎，近來發展了一種微型IEF/PG-PAGE雙向電泳，第一向IEF-PAGE是在內徑為1.3 mm、長度42 mm的毛細管鍾製膠與電泳，第二向是在50x38 mm的微型膠板上進行電泳。其原理與IEF/PG-PAGE完全相同。微型IEF/PG-PAGE與IEF/SDS-PAGE比較，有以下3個特點：
(1) 微量、快速。樣品體積僅需1-2μl，相當於50-150μg蛋白質，電泳時間從一般的十幾到幾十小時縮短為三小時左右即可完成。
(2) 樣品耗損小，因省略了第一向電泳與第二向電泳之間凝膠條的平衡步驟，存在於凝膠條中的蛋白質成分不會損耗。
(3) 保持了蛋白質天然構象與活性，在這兩向電泳體系中，不含蛋白質變性劑，因而有利於蛋白質活姓檢測。
目前，微型IEEF/PG-PAGE雙向電泳在醫學、生物化學、分子遺傳學等各領域應用較為廣泛。
※ 參考資料: 李建武等合編 生物化學實驗原理和方法 P114~146 藝軒圖書出版社 (1999)
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