等電點沉澱法
所有的氨基酸均為兩性物質，亦即它們至少含有一個酸性基（carboxyl）及一個鹼性基（α-amino）。這些可游離的團基在pH變化時，因釋出或接受質子而可充當弱酸或弱鹼，其離子化特性與其它物質一樣遵守Henderson-Hasselbalch方程式：
pH = pKa + log10 [未質子化的形式（鹼）] / [已質子化的形式（酸）]
即
pH = pKa + log [A-] / [HA]
氨基酸可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）或雙極性離子（dipolar ion）及負電荷（anion）等三種，若在酸性溶液中帶正電荷，則在鹼性溶液中帶負電荷。若氨基酸在某一pH值下其淨電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。因為淨電荷為零，淨電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質於等電點的pH值下，其溶解度最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白質分子所帶淨電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會凝結。所以，將pH調到等電點的大小，則大部份的蛋白質將會沉澱，這種現象可以應用於估算某蛋白質的等電點；另一方面，也可以應用在電泳，達到分離蛋白質混合物的目的，這種方法稱為等電聚焦電泳（isoelectric focusing），簡稱為IEF。
Isoelectric focusing是在具有pH梯度環境中進行的電泳。將蛋白質置於不同pH梯度的膠體進行電泳，它會朝著與自身所帶電性相反的電極方向移動，直到抵達與等電點（pI）相同的pH值處才停止，如果它移到別的pH處，會因為帶電而再度移動回和它pI相符的pH處，這就是為什麼此法被稱為「focusing」的原因。
上圖左以A，B兩種蛋白質為例，作出它們的淨電荷曲線圖，橫軸代表環境中的pH值，縱軸代表蛋白質的淨電荷，在pH6.5時，A帶有兩個正電荷，B帶有一個負電荷。使A與B的淨電荷為0的pH值分別為pH9和pH5，這就是它們的「等電點」。
上圖右是A與B在isoelectric focusing gel中移動的情況，一開始將A與B加在膠體pH值為7的地方，之後兩種蛋白質會移往與各自等電點相符的pH處，A是pH9，B是pH5。
一般形成Ph梯度有2種方法：
(1)人工pH梯度，這是在電場存在下，用兩個不同pH的緩衝液互相擴散平衡，在其混合區間即形成pH梯度，但這種pH梯度受緩衝液離子電遷移和擴散的影響，因而pH很不穩定，常見於製備柱電泳。
(2)自然pH梯度，這是60年代初，Svensson（後來改姓Rilbe）引入的概念，並利用數學推導，為等電聚焦奠定了理論基礎。自然pH梯度是利用一系列兩性電解質載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的平滑和連續的pH梯度，此pH梯度進程取決於各種兩性電解質的pI、濃度和緩衝性質。因為擴散和電移動所引起物質移動處於動態平衡，所以在防止對流的情況下，只要有電流存在就可保持穩定的pH梯度。在此pH梯度中，各種蛋白質遷移到各自的pI處，而得到分離。PH梯度的形成是IEF的關鍵，Svensson設想理想的兩性電解質載體應具備下列條件：
(1)易溶於水，在pI處應有足夠的緩衝能力，形成穩定的pH梯度，不至被蛋白質或其他兩性電解質改變pH梯度。
(2)在pI處應有良好的導電及相同的電導係數，以保持均勻的電場。
(3)分子量小，可通過透析或分子篩法除去，便於與生物大分子分開。
(4)化學性能穩定，與被分離物不起化學作用，也無變性作用，其化學組成
不同於蛋白質。
要製作含不同pH梯度的膠體，首先必須準備酸性與鹼性的acrylamide溶液，利用gradient maker將兩者緩緩以不同比例混合，如下圖所示：
酸和鹼的溶液，加入的量會被自動控制，因為調配酸性溶液時，將其比重加大，故一開始它會沉在下面，隨著鹼性溶液加入，pH慢慢提高，整片膠體便產生pH的梯度。
目前，兩性電解質載體商品由於生產廠家不同，合成方式各異，而有不同的商品名稱，如Ampholine(LKB公司)、Servalyte（Serva公司）、Pharmalyte（Pharmacia公司）。IEF-PAGE分離蛋白質並測定pI時可先選用pI 3-10的兩性電解質載體，以及同一範圍的標準pI蛋白質，將其與樣品同時電泳，固定染色後，就可以pH為縱軸，具陰極遷移距離(cm)為橫軸，做出pH梯度標準曲線，根據染後蛋白質遷移距離，可推知其pI。為進一步精確測定未知物的pI，還可選擇較窄範圍的兩性電解質進行電泳，以提高分辨率，得到更準確的pI。如實驗時，無標準pI蛋白質作為標定依據，則電泳後立即用表面微電極每隔0.5公分直接測定膠板的pH值，製作pH梯度曲線，染色後根據遷移距離推知某種蛋白質的pI。
誠如前面所提，梯度膠體目前廠商已上市，一般的pH範圍是3到10，針對所要觀察蛋白質的性質，也可以選擇3到12，4到7，6到11，6到9的特製凝膠。買來的膠條在使用前需進行「復水」（rehydration）的動作，復水用的緩衝液成份視膠體而定，時間從6小時到overnight不等。整個步驟如下：
先在下方的「reswelling tray」中滴入復水用的溶液，再將膠條放入，小心去除氣泡，使膠體與溶液均勻接觸，覆上一薄層的蠟油防止水份蒸乾，最後蓋上蓋子。
樣品也可以在膠條復水的時候一起加入，方法如下：可以選擇復水之前加入（左），也可以在復水6小時後加入（右），前者的復水時間要超過12小時。
將加好樣品的膠條架上電泳槽，即可開始進行電泳：
一個電泳槽可以放置數個膠條，電源供應器能設定不同條件，最高提供8000伏特的電壓，並附有冷卻系統，避免高電壓帶來的高溫影響膠體的品質。 雖然電泳槽的設計，可以讓長短不同的膠條一起進行電泳，但仍不建議將大小、pH梯度不同的膠體一起進行實驗。
當用PAA（polyacrylamide）或瓊脂醣（agar）作為穩定介質時，有時最後測得pH梯度常與兩性電解質載體標明的pH範圍有差別，這可能與電內滲有關。因此IEF必須使用無電內滲的高純度穩定介質。在IEF-PAGE中，丙烯醯胺純度極為重要，最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6或採用類似H+和OH-混合樹脂除去丙烯酸，其效果較再結晶法更佳。在IEF-PAGE中，凝膠只是一種抗對流支持介質，並無分子篩作用，因此凝膠濃度的選擇只要形成的孔徑有利於樣品分子移動就行，一般用5%或7%均可。
兩性電解質載體是IEF-PAGE中最關鍵的試劑，直接影響pH梯度的形成，以及蛋白質的聚焦。因此，要選用優質兩性電解質載體，在凝膠中，其終濃度一般為1-2%。PH梯度的線性依賴於兩性電解質的性質，選擇哪種pH梯度範圍的兩性電解質載體，則與被分離蛋白質的pI有關。
應選擇在電極上不產生易揮發物的液體，作為電極緩衝液，陰陽電極溶液的作用，是避免樣品及兩性電解質載體在陰極還原，或在陽極氧化，其pH應比形成pH梯度的陰極略高，比陽極略低。值得注意的是，不同廠商合成兩性電解質方法不同，應根據說明書選用有關電極溶液。
在採用AP催化化學聚合時，為防止氧分子存在影響聚合，因此加AP前應將溶液抽氣。此催化系統在鹼性條件下容易聚合，在酸性條件下(pH<5)凝膠聚合比較困難，這可能是在酸性條件下，AP不能充分產生出氧原子，使單體成為游離基，因而阻礙凝膠聚合，可在凝膠中加入1%的AgNO3促使凝膠聚合。凝膠聚合後，為防止酵素活性降低，在加樣前進行15-30 min欲電泳，然後將樣品放在其pI附近。
在pH 3-10、中性及鹼性pH條件下，加入TEMED可加速凝膠聚合，但在pH<5時則加速作用較少。TEMED本身為鹼性物質，在pH 4.5以上能擴展PAA凝膠鹼性端pH梯度，其擴增幅度與TEMED加入量有關。實驗表明在20 ml凝膠溶液中，加入50 ul TEMED，在距陰極0.3 mm處可擴展0.7 pH；加100 ul TEMED在陰極處能擴展1.3 pH，也就是說pH 3.5-9.5的兩性電解質載體可擴展到pH 3.5-11的梯度範圍。因此加入TEMED對鹼性蛋白質的分析極為有利，可用於分離細胞色素c、組蛋白等。
實驗證實，鹽離子可干擾pH梯度形成，並使區帶扭曲。例如，將L-胺基酸氧化酵素分別溶於不同濃度的NaCl, Tris-HCl緩衝液中，從IEF-PAGE染色圖譜可看出，高濃度及低濃度Tris-HCl緩衝液對pH梯度形成影響較小，而NaCl及磷酸鈉緩衝液干擾pH梯度形成並使區帶扭曲。為了防止上述影響，進行IEF-PAGE時，樣品應透析或用Sephadex G-25脫鹽，也可將樣品溶解在水，或是低鹽緩衝液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白質在等電點附近，或水溶液及低鹽溶液中，溶解度較低，則可在樣品中加入兩性電解質，如加入1%甘胺酸或對1%甘胺酸透析，雖然甘胺酸是兩性電解質，但不影響pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶極矩作用增加蛋白質的溶解性；也可將樣品溶解在含有2%兩性電解質載體中，因他含有可反應的胺基，並能除去氰酸鹽，此時樣品最好加在經預聚焦的凝膠板的陽極側，因在pH 5以下，既沒有氰酸鹽也沒有胺基甲醯化存在。此外，還可在樣品及凝膠溶液中加入分離子去污劑如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同濃度的尿素(4 M)，為防止氰酸鹽引起蛋白質的胺甲醯化，含有尿素的樣品及凝膠板只能當天使用。
加樣樣取決於樣品中蛋白質的種類、數目及檢測方法的靈敏度。如用Coomassie Blue R250染色，加樣量可為50-150 ug；若用銀染色，加樣量可減少到1 ug。一般樣品濃度以0.5-3 mg/ml為宜，最適加樣體積為10-30 ul。如樣品很濃，可直接在凝膠表面加2-5 ul；如樣品很稀，可加樣300 ul。將其放在一特製的塑料小框中，或用一塊泡沫塑料及高品質的濾紙，也可用擦鏡紙吸取樣品放在凝膠表面。由於IEF-PAGE是按蛋白質的pI分離，電泳後各種蛋白質被濃縮並停留在其pI處。電泳後均可得到同樣的結果。值得指出的是：對不穩定的樣品可先將凝膠進行15-30 min預電泳，使pH梯度形成，然後將樣品放再靠近pI的位置以縮短電泳的時間，但不要將樣品正好加在pI處和緊靠陽、陰極的膠面上，以免引起蛋白質變性造成條帶扭曲。一般加樣電泳半小時後，取出加樣濾紙以免引起拖尾現象。
電功率是電流與電壓的乘積。在IEF電泳中，隨著樣品的遷移越接近pI時，電流則越來越小。為使各成分能更好地分離，要保持一定的電功率，就應不斷增加電壓，電壓增高可縮短pH梯度形成，和蛋白質分離所需的時間，但過高的電壓會使凝膠板局部範圍，由於低傳導性和高阻抗而過熱、燒壞，為此，在電泳過程中，應通冷卻水，水溫以4-10℃為宜，流量5-10 l/min。避免使用過低的溫度，以免冷凝水滴形成。超薄板(0.5 mm)TFE分辨率高就是因為易冷卻。
IEF-PAGE時間與電功率取決於多種因素、如聚丙烯醯胺的品質、AP和TEMED用量、膠板厚薄、兩性電解質載體的導電性和pH範圍。窄pH範圍電泳時間比寬pH範圍時間長，這是因為在窄pH範圍蛋白質遷移接近pI，帶電荷少，故遷移慢。為了提高分辨率，就要增加電壓，縮短電泳時間，防止生物活性喪失。對未知樣品可進行不同電壓、時間的電泳實驗，此時可將有色蛋白質（如血紅素）作為標誌，將其放在不同位置，當聚焦帶遷移到同一位置時，說明已達到穩態，一般寬pH範圍電泳時間以1.5-2 h為宜。
IEF-PAGE操作簡單，只要一般電泳設備就可進行，電泳時間短、分別率高、應用範圍廣，可用於分離蛋白質及測定pI，也可用於臨床鑑別診斷、農業、食品研究及動物分類等各種領域。隨著其他技術的不斷改進，等電聚焦電泳也不斷充實完善，從柱電泳發展到垂直板，又進而發展到超薄型水平板等，還可與其他技術或SDS-PAGE結合，進一步提高靈敏度與分辨率。
參考資料:
Reiner Westermeier, Tom Naven
Proteomics in Practice- A Laboratory Manual of Proteome Analysis
p187~p197 WILEY-VCH (2002)
整理: 施純如
李建武等合編 生物化學實驗原理和方法 P155~163 藝軒圖書出版社 (1999)
整理: 黃信明