蛋白質結構
整理: 黃信明
一、肽鍵的平面性質(Planar nature of the peptide bond)
四、纖維狀與球狀蛋白(Fibrous and globular proteins)
3.蛋白質的三級構造(Tertiary structure of proteins)
一、高度解析X-射線結晶學(High resolution x-ray crystallograply)
二、極性與非極性胺基酸(polar and nonpolar residues)
三、蛋白質的摺合(Folding of the protein molecule)
將蛋白質中胺基酸順序視為整體構造，是一種用有機化學詞語來描述分子的完全方法。自很多不同蛋白質的順序分析中可以看出，每種蛋白質都有其獨特的結構，而順序排列即是該種系的特性。在少數的情形中，特殊的器官或組織也具有特定結構的蛋白質，更進一步的，蛋白質可以如細胞分裂一般很正確地被複製出相同順序的蛋白質。我們可以參考牛的胰島素(Bovine insulin)；更正確地說，是參考proinsulin。Proinsulin為生物活性賀爾蒙的先質(precursor)，藉著正常牛的胰臟島狀細胞仔，細地做成的一種特定構造。牛的胰島素和其他哺乳類的胰島素幾乎是相同的，通常只有一個胺基酸不同，即A鏈中第8，9或10位置胺基酸的改變。這些相似性使得這方面的研究迅速擴展，雖然在不同種類中，胺基酸會發生變化，但在18位置的胺基酸很明顯地絕不會改變。研究不同種系中蛋白質的順序，是現在研究構造與功能間關係的一種方法。
蛋白質的一級構造提供了我們分子有機-化學的性質描述，但卻不能描述蛋白質中聚肽鏈的構造，必須使用其他實驗方法後才能得到蛋白質分子的真正構造。
一、肽鍵的平面性質(Planar nature of the peptide bond)
四、纖維狀與球狀蛋白(Fibrous and globular proteins)
一、肽鍵的平面性質(Planar nature of the peptide bond)
用物理方法測定不同種類的蛋白質，顯示球狀蛋白質(globular protein)不適合用直線延展的聚肽鏈表示，而要用緊而高度摺疊的結構表示。因此蛋白質分子的完整描述，必須包括聚肽鏈之形態，以及支鏈上取代基的位置、鍵結的詳細分析。蛋白質的二級構造，正是和聚肽鏈的三度空間排列有關的構造。
Pauling與Corey用x-光繞射(x-ray diffraction)研究個別的胺基酸，以及許多dipeptide與tripeptide，以此建立peptide的結構單位。α-碳原子的鍵角及鍵長是和標準的正四面體的碳相同，然而在peptide bond中C-N鍵的長度則在單鍵及雙鍵長之間；peptide bond的部分雙鍵性質有助於Pauling及Corey瞭解peptide bond的面性質。在peptide bond上的四個取代基(substituents)幾乎全部都是反式配置(trans-configuration)，因此在carbonyl group上的氧與在氮上的氫，位置是成對角線的。
在有兩個或更多的胺基酸參與聚肽鏈結合時，peptide bond的平面性質受到排列及方向的限制；既然α-碳是作為兩個胜肽平面間的轉軸點(Swivel point)，故可利用C-N鍵角的旋轉-角Φ，和C-C見角的旋轉-角ψ來描述其排列方向。一般而言為了減低空間阻礙(steric hindrance)、增加相鄰原子群的穩定性，造成旋轉的角度-即相鄰平面構造的方向，所以peptide bond 上巨大的carbonyl group，其位置必須儘可能遠離相鄰的羧基及α-碳取代基。這些關係限制了相鄰碳鏈的自由度(degrees of freedom)、角Φ及ψ的旋轉。
在聚肽類的結構中，氫鍵的位能也是一種重要的穩定因素。由於peptide bond使得一個peptide bond中的carbonyl group與另一個peptide bond中的醯胺基可能產生相互作用力，所以雖然氫鍵的吸引力很弱，但在聚肽鏈中因有很多可能的氫鍵發生，所以氫鍵成為使聚肽穩定的一個重要因素。具有最大氫鍵位能的兩種聚肽鏈形態，就是α-螺旋狀體(α-helix)和β-結構(β-structure)。
Pauling及Corey在1951年提出了α-螺旋狀結構為二級構造中的一種型式之假設，此種結構因為具有天生的穩定性，而在自然界中可以存在。α-螺旋狀體是一種聚肽類的旋轉排列，直鏈繞著中心的軸旋轉，每一胺基酸從螺旋中以一定形態伸出。此螺旋體每旋轉一次有3.6個胺基酸，並且螺旋上下兩層間與軸平行的距離是5.4A。由此可知每一個胺基酸會有1.5A (5.4/3.6)的上升距離。此種空間結構排列極為嚴密，使得螺旋狀結構中的氫鍵位能達到最大。
在α-螺旋狀體中，每一胺基酸carbonyl group上的氧，與同一螺旋狀體中，該前方第四個胺基酸中醯胺的氫，會產生氫鍵，氫鍵的位置幾乎是和螺旋狀體的軸是平行的。此種螺旋狀結構及由氫鍵造成的穩定效果，形成外型為圓筒狀，相當穩固，但在伸縮及彎曲時形態會有可逆性的改變。
多數的胺基酸，都可以作為α-螺旋柱結構單位，Proline是一個例外，因為它是環狀結構，所以不會在螺旋狀體中發生；具有巨大支鏈如Valine及isoleucine般的胺基酸，也會中斷阻礙螺旋狀結構。凡不能做為螺旋狀體結構單位的胺基酸，都視為螺旋狀體”破壞者”(Breakers)。
Pauling及Corey在1951年同時提出二級構造的另一種型式，稱為β-結構或摺片狀(pleated sheet)的聚肽鏈排列。在此種形態中，許多的聚肽鏈邊靠邊緊密接觸，這些鏈藉著分子內氫鍵而穩定結構。為了要增加鏈和鏈之間的最大氫鍵數目，聚肽大小必須比完全延展開來的長度略短，使得胜肽類的基幹看似皺起，其形態和摺片相似。在β結構中的支鏈位置，是在片狀的上方或下方，相鄰胺基酸的支鏈方向互不相同。在摺片狀構造中的肽鏈排列，可能是彼此同向平行，或者是反向平行。在同向平行的結構中，所有的肽鏈均是由胺基一端排列到羧基一端的相同方向，而在反向平行的結構中，相鄰各鏈的方向彼此互不相同。
四、纖維狀與球狀蛋白(Fibrous and globular proteins)
纖維狀蛋白質在某些情況下視為α-螺旋狀結構，而在其他狀況下為β-結構。如頭髮的α-角蛋白類(α-keratin)是以α-螺旋狀體為結構之外型；而β-結構則在絲的絲膠蛋白(sericin)中可以發現。纖維狀蛋白的二級構造較球狀蛋白的二級構造規則得多。典型的球狀蛋白是不能用任何單一的二級構造來描述，而要用包括α-螺旋狀體的片斷，β-結構單位，及不規則或無重複性的結構三者總和之形態描述。
闡述球狀蛋白的二級構造是一種很困難的工作，必須和研究蛋白質晶體的x-射線繞射分析合用。從1961到1963年報告中，kendrew出版的肌蛋白(myoglobin)三度空間電子密度圖(Three dimensional electron density maps)及Peruty的血紅素，為我們在瞭解蛋白質的詳細分子構造上建立了一個新的紀元。
肌肉細胞中和氧結合的蛋白質是一種單一的聚肽鏈，具有153個胺基酸，並由非共價性吸引力和一個原血紅素基(heme group)結合。Kendrew建立了這骨幹形態並且注意到佔有胺基酸總數70%的八個α-螺旋狀體部分的存在。α-螺旋狀體部分像一種穩固的圓筒結構，在空間中之結構與Pauling和Corey所提出的結構極為相似。延展型式的聚肽鏈之部分和α-螺旋狀體區域相連接，這使得整個鏈可以彎曲及旋轉。若從氮一端開始順著聚肽鏈之方向，很明顯的看出鏈會改變方向，並從前方轉到背後。整個摺疊的效應使得整個結構縮緊，並且造成橢球之形狀。
肌蛋白及血紅素較許多他種的球狀蛋白含有高量的α-螺旋狀體區域。最近在酵素上的研究，如雞的蛋白溶菌酶(egg-white lysozyme)，牛的乳凝乳蛋白酶A(Bovine Chymotrpsin A)，牛的核醣核酸酶(Bovine ribonuclease)及木瓜酵素(papain)，顯示出螺旋狀體的量從chymotrpsin中僅數捲，到在papain中佔全部胺基酸的20%。在chymotrpsin的三度空間結構裡，聚肽鏈有很廣泛的摺疊，只有C-端八個胺基酸是α-螺旋狀體形態。聚肽鏈主要是延展的形態，鏈之區域間彼此是反向平行。Lysozyme及許多其他種類的酵素，及除了延展的鏈狀及α-螺旋狀體區域以外，具有β-結構。β-結構當存在於lysozyme中是以同向平行，但在ribonuclease及papain中卻是反向平行的結構。
3.蛋白質的三級構造(Tertiary structure of proteins)
一、高度解析X-射線結晶學(High resolution x-ray crystallograply)
二、極性與非極性胺基酸(Polar and nonpolar residues)
三、蛋白質的摺合(Folding of the protein molecule)
一、高度解析X-射線結晶學(High resolution x-ray crystallograply)
為求瞭解球狀蛋白中胺基酸的排列，必須使用具有高度解析力(1.5到2A)的x-射線繞射圖形來研究。電子密度圖代表蛋白質晶體內不同程度的單元體。這些三度空間電子密度分析和胺基酸的順序分析合用，可決定每一個組成胺基酸原子的位置。有了這些資料後，便可以建立一個三度空間結構的蛋白質分子模型。
x-射線繞射分析法進步得很快，許多不同生理功能、不同大小及不同聚肽鏈數目的蛋白質分子組成，都用這種方法分析。這些研究顯示，典型的球狀蛋白是緊密的、具有廣泛摺疊的聚肽鏈。此種分子緊密的性質，使得分子將其胺基酸支鏈都擠到彼此互相接觸的地步，接近的距離足以促進支鏈間的反應。蛋白質的三級構造，即是指在摺疊分子中支鏈的排列位置。
在極性原子群間會發生氫鍵及鹽類連接(Salt linkages)；在非極性原子群間發生疏水(hydrophobic)及凡得瓦(Van der Waals)作用力，雙硫鍵即是一種特殊型式的支鏈反應，這是將兩個Cystine胺基酸連接的一種共價鍵。雖然支鏈的非共價性吸引力是一種較弱的吸引力，但由於造成此種吸力的原子群很多，所以這種吸引力成為一種重要的穩定因子，和在二級構造中的氫鍵類似，可以看出二級構造和三級構造是有很密切的關係的。
二、極性與非極性胺基酸(polar and nonpolar residues)
將胺基酸分類為極性或非極性，對於確定蛋白質結構中支鏈的功能很有幫助。以物理-化學研究為基礎，在不同溶劑中的溶解度大者，即在表面與內部胺基酸的位置，可以很容易的將胺基酸分成兩大類。極性的胺基酸也稱為親水性胺基酸，含有能夠形成氫鍵，或與合適共存者形成離子鍵的支鏈原子或官能基。在此群中的有酸性、鹼性、脂肪醇、及醯胺取代基。
非極性胺基酸則藉著脂肪族或芳香族支鏈取代基之存在與否來分辨。在水溶液環境中，這些碳氫支鏈有利於自身結合或形成疏水鍵。疏水性吸引力對於天然蛋白質的形態及穩定性有極大的貢獻。必須注意的是，有些胺基酸同時包含有極性與非極性的取代基。Tyrosine具有極性的酚基及非極性的芳香環，tryptophan具有極性的indole而其餘支鏈為非極性。Glutamic acid及lysine具有極性官能基也具有非極性的methylene，這種混合的型式，使得摺疊狀態下胺基酸間的吸引力變通性增大。
在內部極性基若有氫鍵或離子鍵的形成，穩定性會增加。球狀蛋白的二次構造包括內部α-螺旋形區域及β-結構，並在peptide bond與支鏈取代基間有氫鍵的形成。在無水的環境中，內部埋藏的離子基傾向於形成離子對。在特殊蛋白質中，所形成鍵的型式決定於胺基酸排列的順序，但一般而言，摺合的結構使得內部極性基間的吸引力達到最大。
三、蛋白質的摺合(Folding of the protein molecule)
有作用的胺基酸支鏈，在特定的形態下，有使整個大分子結構穩定的功用。我們也可以看出這些同樣的反應，可幫助聚肽鏈從不規則組合的狀態，摺合成具有生化活性標準形態之分子。
由Anfinsen及他的同事所做之一連串實驗，顯示出聚肽鏈的摺合是一種自然發生的過程，協同因子(co-factors)及酵素催化反應與其均無關係。在摺合的過程中，聚肽鏈會經歷多次形態的轉換，以達到一種具有最大穩定性的特定結構。換一句話說，也就是聚肽鏈會尋找一種具有最低自由能(free energy)的結構，顯示出聚肽鏈的一級結構順序，決定了摺合蛋白質分子的最終形態。
這些結論是從變性的核醣核酸(ribonuclease)，以及其他酵素之再摺合的研究而得出的。用8M尿素(urea)及乙基硫醇(mercaptoethanol)處理核醣核酸(ribonuclease)，前者作用在於使分子的摺合解開，後者造成四個雙硫鍵的還原。經過轉變的分子含有八個硫氫基(sulfhydryl group)，失去生化活性；並且其物理性質也和預測的變性分子性質相符合。然後將8M尿素(urea)及乙基硫醇(mercaptoethanol)移去，置於合適的緩衝液中，在pH 8.0下進行雙硫鍵的氧化，這些狀況導致四個雙硫鍵形成，伴隨著酵素活性的恢復，而恢復蛋白質的性質和天然分子的性質相似；由於活性分子的生成量很高，表示平衡是有利於摺合狀態的。
需要注意的是8個硫氫基(sulfhydryl group)有105種形成雙硫鍵的方法，若polypeptide的摺合是一種隨機過程，則會形成105種不同結構，最多只有百分之一的機會形成正確的核醣核酸酶。而觀察到的生成量卻很高，並且再生的核醣核酸酶中雙硫鍵之正確配對，顯示只有一種組合狀態是有利的。因此蛋白質中胺基酸順序指導其分子的三度空間結構，同時可假設這些實驗觀察，也適用於蛋白質分子生物合成相關的摺合過程。
※ 參考資料: 王立禾, 阮立昂譯 蛋白質構造與功能 P6~14 復漢出版社 (1977)