發酵與酵素

發酵與酵素

整理：廖竟妤

1.醱酵作用（fermentation）的起源

一、古埃及人如何得知製酒與製麵包的過程？

二、古埃及人如何製作麵包？

2.醱酵作用的元兇

一、什麼是醱酵作用？

二、醱酵過程與酵母菌存在的有無有絕對關係嗎？

三、酵母菌在醱酵過程中所扮演的角色為何？

四、酵素作用過程一定要有完整的細胞參與其中嗎？

五、酵素作用時需要其他物質的幫忙嗎？

3.結論

4.參考資料

1.醱酵作用（fermentation）的起源

埃及人很早就知道利用醱酵來製造酒類。造酒的原理是利用穀類或水果中的糖分，培養酵母菌使之生長醱酵，所產生的代謝物中，有一部份是酒精，另有一小部份芳香物質，造成了吸引人的酒類風味。古人不知酵母菌的作用，因此覺得造酒過程中有種神奇的轉換力量，可以把穀類或水果變成好喝的酒（6）。

一、古埃及人如何得知製酒與製麵包的過程？

考古學者在史前2500年的埃及Theban法老王墳墓內找到經醱酵的麵包實體和證明酒與啤酒釀造的壁圖及實物，另外在公元前2698年中國史記自黃帝開始已有教民烹煮麵食的記載，都證明人類在有歷史以前就懂得種植稻米、小麥以及儲存、磨粉和利用酵母醱酵，調製不同的食物。據推測人類在史前三千年已懂得使用酵母醱酵技術，雖然不知原理，但已具有熟悉經驗，至於何時開始利用小麥為食糧，則無從考據，僅可從古老的洞穴中找到先人貯存的麥粒，推測人類在公元一萬年前就懂得使用小麥或其他榖類作為糧食（7）。

文字方塊: 圖一
古埃及壁畫（20）。文字方塊: 圖二
宴會情景，以麵包、啤酒宴客（20）。

二、古埃及人如何製作麵包？

公元前9000年已有麵包，但酵母的發現卻遲了7000年，直至公元前2000年左右，尼羅河流域盛產小麥，古埃及人已開始將小麥磨成粉，加入水、馬鈴薯及鹽拌在一起，擺在溫熱的地方，空氣中的酵母落入一塊未被烤過的麵糰中，麵糰竟慢慢地脹大起來，這種麵糰烤出來後非常鬆軟，從此人們便故意留一塊麵糰，讓酵母慢慢使它發大、變酸，再取一團作「麵種」留待下次發麵包。古埃及人只知道方法，卻不懂得其原理，因此一直認為這是神在暗中幫忙，而認定麵包是「神的贈禮」（8）。

文字方塊: 圖四
製作麵包的模型（20）。文字方塊: 圖三
金字塔中的麵包（20）。

2.醱酵作用的元兇

一、什麼是醱酵作用？

1785年，法國化學家Antoine Laurent認為醱酵作用是一種化學變化的過程；他認為糖像是一個尚未加工過的物質，經過醱酵過程產生了酒精及二氧化碳。因此他認為是由於化學作用的緣故而使糖分子被分解形成酒精及二氧化碳（18）。Anselme Payen（1795－1871）是一位法國化學家，在1833年他從甜菜中提煉出糖，發現從麥芽萃取液中有一樣物質可以加速澱粉轉變為其他較簡單的糖類，取名為diastase---澱粉酵素(amylase---澱粉酶)。研究發現diastase (amylase)在熱環境下極不穩定（9）。早在1783年Spallazani氏觀察到胃液中含有一種物質，能行體外消化之現象（3）；而1834年德國生理學家許旺（Theodor Schwann，1810－1882）從胃中純化出一種物質和鹽酸(hydrochloric acid) 混合之後，發現分解的速度變快了許多。1836年，許旺利用氯化汞（mercuric chloride）將純化物沉澱出來，並命名為胃蛋白酶（pepsin），之後胃蛋白酶就被歸類到酵素（ferments）一群之中（9）。

二、醱酵過程與酵母菌存在的有無有絕對關係嗎？

1837年，在法國的杜爾（Cagniard de la Tour）開始在各啤酒場的釀酒桶裡搜尋，拿出桶中的汁液放在顯微鏡下觀察，發現裡面的球狀酵母菌會發芽，就像種子發芽一樣，進一步研究發現假如沒有這些活生生的酵母，只憑啤酒花和大麥是無法釀成啤酒的，所以他認為一定是酵母菌將大麥變成酒精（1，2）。

酵母菌在醱酵過程中的角色一直持續爭執了將近60年（1839－1897），德國化學家利比克（Jutus von Liebig）及法國化學家路易巴斯德（Louis Pasteur）一直至死都還無法達到共識，直到最後由兩位德國化學家來結束這段漫長的爭議。最近世紀中期，方才了解醱酵作用是一種化學過程。

1839年，一位傑出的德國化學家利比克（Jutus von Liebig）則觀察出啤酒中的酵母菌被置放在水中就會裂解成許多更小的球狀，當這些小球被放置在糖水中就變成了一個個小的動物一般。而在1846年，化學家柏濟力阿斯（Berzelius，1779－1848）提出催化（"catalyst"）一詞，他認為在醱酵過程中是一個物質a使另一個物質b轉變，但是物質a並沒有改變。換句話說，他認為是酵母菌催化了糖的醱酵，但卻沒有生物活性存在其中。利比克贊同他的理論，他發現當酵母菌死亡後糖類變成酒精與二氧化碳的醱酵作用的過程變慢了。其實在牛奶中也發現這個相同的現象來支持他的論點。他建立一個機制說明酵母菌在醱酵的混合液中如同一個分解的物質，釋放出某種震動，使糖類被破壞後可以重新組合形成酒與二氧化碳。他描述醱酵過程是由一種可改變的物質分解而引發出的化學變化，使原基質產生醱酵作用。根據這個觀念，認為引起醱酵作用的主要原因，是一種化學不穩定性所造成。而許旺（Theodor Schwann）則描述醱酵作用完全是依靠酵母菌所產生的過程（2，3，10，11，18）。

三、酵母菌在醱酵過程中所扮演的角色為何？

路易巴斯德（Louis Pasteur，1822－1895）證實了許旺的觀察，他認為一個活生物，在一種化學變化中必須要有酵母，可轉糖為酒精與碳酸。1854年巴斯德三十二歲，被聘為里爾（Lille）地方新設立的科學系系教授及主任。里爾最主要的工業是從甜菜和榖物釀酒。大家都期盼著這位新來的化學教授，大顯神通來解決釀酒業所發生的各種問題。當時的化學家可以寫出糖水醱酵變為酒的反應方程式，卻知其然而不知其所以然。雖然有極少數的學者聯想到酵母菌和醱酵的關係，但僅是空泛的推論而已。巴斯德一向都認為醱酵不僅僅是一種化學現象，他慎密地在當地工廠搜集實驗的材料，從沒有問題的桶中取出樣本並在顯微鏡下看到活的酵母菌；再從有問題的桶中取出樣本先聞一聞，再嚐一嚐，然後用一張藍色的石蕊試紙測試，發現它馬上變成紅色，並在顯微鏡下觀察，並沒有發現酵母菌的蹤影。而在有問題的樣本瓶中發現有許多灰色的小點附在瓶內，取下後在顯微鏡下觀察，看到的不是酵母菌而是一群扭來扭去、游來游去的桿狀物，它們不停的震動著，比酵母菌還小，他發現有問題的樣本中存在的不是酒精而是乳酸，因此他有了一個想法：酵母菌是酒精的醱酵劑，而桿狀物則是乳酸的醱酵劑。他將乾燥酵母煮沸過濾後再加入定量的糖和少許的蘇打，以防止汁液變酸；接著從有問題的桶中取出一些灰色的東西放入汁液中培養。結果在顯微鏡下發現桿狀物是活的，會繁殖。他認為促成醱酵作用的是一批活生生的東西，是一批肉眼看不見的生物；因此他告訴比果先生只要防止微小桿菌在桶中孳生，一定可以釀出酒來（1，10，12）。

利比克（Liebig）此時最反對他的看法，他認為糖轉變成酒精與酵母菌無關。他認為由於有胚乳的存在，所以當胚分解時連帶著將糖分解為酒精。巴斯德為了粉碎利比克的想法所以他只要在完全不含胚乳的汁液中培養一些酵母，且可以將糖轉變成酒精這樣就成了。他無意中放了一些銨鹽在不含胚乳的汁液中，發現酵母菌在其中不斷的繁殖生長且銨鹽一直減少，所以酵母菌並不需要胚乳也可以生長。接著他用酒石酸銨與糖培養酵母菌，發現酵母菌真的可以在其中繁殖生長，而且它們一直在製造酒精與含有碳酸氣體的泡沫，所以他認為醱酵與完整的活細胞是不可分的。經過一次再一次的試驗終於證實活的酵母菌可以使糖水醱酵變酒（1）。

此外，他發現在酒中除了酵母菌外，還有其他的細菌，也就是導致酒變酸變壞的原因。他把酒加熱到攝氏四十五度到六十度，可以防止酒變濁，這就是著名的巴斯德滅菌法（Pasteurization）的由來。巴斯德使釀酒工業走上科學之途。知道如何控制酵母菌，不但使酒的產量大增，也使酒的風味醇美。後來，法國就是依靠酒業驟增的收入，才得以清償巨額的戰債。他在1857年發現各種不同生物，認為生命現象與糖類分解變成乳酸的過程，有極密切關係；且認為有些微生物對某種醱酵作用，佔有重要的地位。在17世紀末期（1680年），荷蘭人雷文霍克（Leeuwenhock）利用當時自製的簡單顯微鏡（約放大300倍）觀察酵母菌、紅血球、原生動物以及細菌。巴斯德利用顯微鏡發現釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），這就是他第一種「見到」的微生物，而醱酵作用就是微生物作用的結果，研究發現在最適合的環境下，有特有的微生物存在時就會產生醱酵作用。他把各種不同的微生物放在顯微鏡下觀察，發現乳酸細菌的醱酵有些地方和酒精醱酵相似，巴斯德在1860年認為醱酵過程中一定必需有酵母菌的存在（1，10，13）。

但在1858年的柏林，Moritz Traube （1826－1894）認為在酵母菌中有某種化學物質體（chemical body）能導致醱酵作用。直到Berthelot發現了酵母菌中有一種酵素稱為轉換酶（invertase），使得蔗糖轉變成葡萄糖和果糖（4）。

四、酵素作用過程一定要有完整的細胞參與其中嗎？

1876 年，庫內（Willy Kühne，1837－1900）從胰臟的分泌物中純化出另一種酵素，並把它命名為 trypsin。庫內是十九世紀的一位生物學家，主張自然生源論，他主張酵素只能在活細胞中作用並產生化學反應。庫內在1877年提出 “enzyme”這個字眼，主要說明是在酵母菌中（"in yeast"）作用的，而由微生物所產生。enzyme是希臘文，en = in 而 zyme = yeast（9）。然而，Naegeli則提出一個新的理論，他認為在酵母菌的細胞質執行糖的分解反應。1890年，費歇爾（Emil Fischer）認為酵素之特異性與其本身和受質之立體構造（分子中原子之間的關係）息息相關，他更由不同構造之受質，觀察其與酵素之交互作用，發現立體構造較為靠近者（互補者）作用較強，最後提出鎖與匙（Lock and Key）之觀念來說明酵素與受質之關係；並由丙三醇（glycerol）合成葡萄糖（glucose）及果糖（fructose）並分析其結構。

Henri 發現當酵素催化過程中酵素必須和受質（substrate）相結合，形成一個穩定的結構（enzyme-substrate），這是催化過程中一個相當重要的步驟。根據這個想法，在1913年德國人Leonor Michaelis 和加拿大人Maud Lenora Menten 提出一個假設：酵素（enzyme，E）首先會和它的受質（substrate，S）形成一個穩定的結構 “enzyme-substrate complex（ES）” ---此過程相當快速；接著此結構會不穩定而被破壞，產生一個新的物質P，最後此酵素E才離開。德國化學家布納氏（Eduard Buchner，1860－1917）在600倍的顯微鏡下觀察酵母菌，他發現在細胞外有一層似水狀的結構（semi-liquid body）環繞著整個細胞。他也發現這個膜並無法使營養物質或某物質進出細胞；而且在這個結構內還有一個特殊結構叫原生質膜（plasma envelope），它同樣控制物質進出細胞。所以他想：既然高分子物質無法進入細胞中，那麼微生物外的高分子物質是如何被分解的呢？

布納氏和其兄弟Hans Buchner於1897年在慕尼黑（Munich）利用壓碎法將酵母細胞磨碎（此法是將細胞膜或原生質膜破壞），以不含細胞的萃取液即可致醱酵作用。他從這些萃取液分離出有效的成份，促使糖類醱酵成酒與二氧化碳，稱之為酵酶（zymase），他是第一位說出酵素可以獨立出細胞而產生作用，布納氏以此項研究在1907年獲得諾貝爾獎。Duclaux於1898年主張每一種酵素或酶以-ase三個字母作為結尾，通常是加在受質的後面（3，4，9，11，14，15）。

五、酵素作用時需要其他物質的幫忙嗎？

英國生物化學家Arthur Harden （1865－1940）於1904年利用透析的方法（他將酵母萃取液放入一個袋中，再將袋子放入純水中，讓袋中的小分子物質通過袋子，而大分子物質則留在袋中；此袋就是我們所說具有半透性的膜---semipermeable membranes）將酵母萃取液分成兩個部分。Harden 發現在袋中的大分子物質並不能產生醱酵作用，但將透析過的水再加回袋中就可以發生醱酵作用了，這說明了酵素可以分成兩個部分。他發現了酵素作用時需輔酶（co-enzyme）的幫忙，且之後的實驗發現此物質在水中並不會因熱而受到破壞（9）。酵素的純化工作自1920年才開始；在1920－1928年間，著名的學者Willstatter及其研究小組發展出一些純化酵素的方法。終於在1926年，康乃爾大學的美國生化學家桑那（James Betcheller Sumner，1887－1955）能從傑克豆（jack bean）中分離出尿素酶（urease），這也是第一個在試管燒杯中以結晶形態獲得的酵素，雖然純度並不很完美，Sumner鑑定此酵素是蛋白質，並且獲得1946年諾貝爾獎。

當第一個酵素被結晶出來，有些保守的人認為那不是酵素本身而是酵素附著在結晶性的蛋白質上（3，15）。而美籍酵素學家John H. Northrop（1891－1987）力排眾議，他及其研究小組又把幾種蛋白酶結晶出來，並將純度大為提高；他在1934年把胃液中之胃液素（pepsin）結晶出來，證明分離出來的酵素結晶就是100﹪蛋白質本身。從1930到1936年之間陸陸續續有胰凝乳蛋白分解酶（chymotrypsin），和胰蛋白分解酶（trypsin）被結晶出來，而更確定了這些催化的物質就是蛋白質（15）。Northrop與Wendell M. Stanley（1904－1971）皆為美國資本主義協會中的一員，一同純化出酵素與病毒蛋白（16）。

1957年，Schaffer氏以雙異丙烷基氟酸酯（diisopropyl fluorophosophate）與胰凝乳蛋白分解酶相混合時，發現酵素的活性隨即喪失，認為酵素之催化活性（catalytic activity）僅與酵素分子中某一部份有關，該部分稱為活性中心（activity center）或活性部位（active site）。酵素動力學（enzyme kinetics）是由於Brown、Henri及Michaelis等科學家的努力，才提供了一些準則以分析酵素作用的步驟，並推演其作用機制（3）。