發展電泳技術和吸附色譜分析法並成功分離出血清蛋白
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius（1902--1971）
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius是瑞典的生物化學家，1902年8月10日，出生於斯德哥爾摩。他就讀於 Uppsala 大學，專攻化學。1925年，他在Svedberg's 實驗室擔任研究助理，完成博士學位，研究論文為"The moving-boundary method of studying the electrophoresis of proteins" (published in Nova Acta Regiae Societatis Scientiarum Upsaliensis, Ser. IV, Vol. 7, No. 4)。1931~1935年間，Tiselius published發表了和擴散及吸附現象相關之論文。由於受到一些生物化學家以及物理化學家的刺激，他返回到 Uppsala大學，恢復了他對蛋白質的研究和物理方法應用在解決生物化學問題方面的興趣。他改進了電泳的分析,且投入血清蛋白之研究和一些其他方面的生物化學。Tiselius亦研究電泳、色層分離法階段分割、凝膠體過濾等等，將生物化學中一些有用方法加以改進，並針對大分子物質，如：蛋白質、酵素、病毒、多醣體以及核酸來加以研究，於1948年得到諾貝爾化學獎，1971年逝世。（註3、9、10）
得獎原因（註22）
對化學家而言，如何分離物質是一門藝術，從欲分離物質的前置處理以及分離之後的分析方法、保存方式等都是非常重要的；而生物化學家所研究的物質通常是生物體內一些大分子，例如：蛋白質、酵素、病毒、多醣體以及核酸等等，其結構通常較複雜，甚至有些是由多個單位所組成；而生物化學家在研究這些大分子時，通常工作分為兩部分：1.分離、純化這些物質 2.對已純化之物質準確地描述其化學特性，以及其參與生物體內化學反應所扮演的角色。而在進行生物化學研究時，常會碰到一些困難，而且在實驗條件、步驟上需要更多考量，例如：（1）在分離處理的過程中，步驟或所添加之藥劑對目標物是否有害，例如：失去活性；（2）在分離過程中，這些大分子容易被分解成簡單的小片段；（3）分離方法的專一性及穩定度等等。
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius根據前人的一些研究，再加上利用這些待測物本身特別的物理－化學現象，即物質在電場中的移動的現象（electrophoresis）以及對固體表面的吸附能力（adsorption），來達到分離的目的。
溶解物在電場中移動之可能因素有：（1）傳遞transference（2）moving boundary method，通常我們會利用提高電壓來增加解析度，但由於會產熱，造成電泳管中溶液密度不同，而產生對流，造成實驗結果失真，通常所採取的改善方法有：1.使用直流電 2.溶液採用 “水”（在4℃時，本身密度高），可使因產熱所引起密度變化效應變低等等。Arne Wilhelm Kaurin Tiselius在設計電泳管時，希望這儀器能具有下列功用，如：（1）可利用光學方法偵測（2）防止對流產生（3）利於回收樣品等等。其中光學方法偵測則是根據位置，以及利用折射指標來做定量分析；而在Schlieren photographs中，則是利用不同物質或混合物其紋影（Schlieren）不同，即邊界的位置不同來判別及分離。此外，溶液的pH值和離子濃度亦會影響電泳的速率，即電壓和電導度為重要因素。Arne Wilhelm Kaurin Tiselius利用moving boundary method（全液相電泳）分離出血清蛋白，血清蛋白中含有下列物質Albumin、a globulin、b globulin、g globulin，並分別就electrophoresis 及adsorption的各項因素來加以探討，例如：在adsorption部分，就分成Frontal / Elution / Displacement analysis，加上參考Claesson的研究，進而改善其設計。他對現代化學和藥物的研究，做出了巨大的貢獻。他對血清蛋白質性質的精確分析，導致了計多藥物的改進。今天，人類健康水平提高，壽命延長，是與Arne Wilhelm Kaurin Tiselius有成效的研究是分不開的。一九四八年，爲了表彰他對電泳現象和吸附作用的分析，特別是對血清蛋白複雜性質的發現，瑞典皇家科學院授予他1948年諾貝爾化學獎。（註11、12）
電泳的歷史（註4）
電泳是一種利用帶電粒子會在電場中移動的分離技術，這種技術及其概念已被二十世紀的科學家普遍使用。
在1937年Tiselius發展了第一個電泳裝置。而這項利用電泳技術來分離蛋白質的實驗使他得到了1948年的諾貝爾化學獎。他發展了"moving boundary"，即為以後大家所熟知的"zone electrophoresis"，Tiselius用這方法來分離血清蛋白質（註4、15）。
這項技術被用於研究蛋白質、胺基酸或者無機的離子,電泳在1940年代和1950年代廣泛發展。除zone electrophoresis以外，還有兩種其他類型的電泳技術：isoelectric focusing 和 isotachophoresi 出現。這三種分離方法是基於不同物理性質。三個方法之間的區別是在於所使用固相材質大有不同。不同膠體物質對不同類型的樣品的分析上有不同優缺點。大致上使用的物質有polymer gels，papers，and capillaries。其中paper是首先被用於分離物質的電泳技術上，之後則是polymer gels被普遍使用。之後亦有人用starch gel和cellulose acetate作為電泳媒介（註4、16、17、18、19）。在1980年代早期，則有人將毛細管（註7）運用於電泳技術上（註4、20、21）。
除此之外用於偵測或分析電泳的系統也越來越進步了。由於大多數利用電泳所分離出來的樣品肉眼是看不見的，故發展了許多偵測和量化的方法，例如：chemical staining，immunoeletrophoretic techniques，two-dimensional electrophoresis，and various blotting techniques等。
而現今電泳技術更廣泛應用於生物方面和其他的聚合物樣品之分析上，甚至用於刑事鑑定、親子鑑定上。
色層分析之歷史（註6）
將一滴含有混合色素的溶液滴在一塊布或一片紙上，隨著溶液的展開，可以觀察到一個個同心圓環出現，雖然古人對現象就已有初步認識，並有一些簡單的應用，但真正首先認識到這種層析現象，在分離分析方面具有重大價值的是俄國植物學家Tswett。Tswett關於色譜分離方法的研究始於1901年，兩年後他發表了他的研究成果"一種新型吸附現象及其在生化分析上的應用"，提出了應用吸附原理分離植物色素的新方法。三年後，他將這種方法命名爲色層分析法(Chromatography)，色層分析法(Chromatography)這個詞是由顔色(chrom)和圖譜(graph)這兩個詞根組成的。由於Tswett的開創性工作，因此人們尊稱他爲"色譜學之父"，而以他的名字命名的Tswett獎也成爲了色譜界的最高榮譽獎。
色譜法發明後的最初二三十年發展非常緩慢。液-固色譜的進一步發展有賴於瑞典科學家Tiselius(1948年Nobel Chemistry Prize得獎者)和Claesson的努力，他們創立了液相色譜的迎頭法和頂替法。分配色譜是由著名的英國科學家Martin和Synge創立的，他們因此而獲得1952年的諾貝爾化學獎。1941年，Martin和Synge採用水分飽和的矽膠爲固定相，以含有乙醇的氯仿爲流動相分離乙酰基氨基酸，他們在這一論文中預言了用氣體代替液體作爲流動相來分離各類化合物的可能性。
1951年，Martin和James報導了用自動滴定儀作檢測器分析脂肪酸，創立了氣-液色譜法；1958年，Golay首先提出了分離效能極高的毛細管柱氣相色譜法，發明了玻璃毛細管拉制機，從此氣相色譜法超過最先發明的液相色譜法而迅速發展起來，今天常用的氣相色譜檢測器也幾乎是在五十年代發展起來的。七十年代發明了石英毛細管柱和固定液的交聯技術。隨著電子技術和電腦技術的發展氣相色譜儀器也在不斷發展完善中，到現在最先進的氣相色譜儀已實現了全自動化和電腦控制，並可通過網路實現遠端診斷和控制
電泳的相關補充
帶電的顆粒在電場作用下向著其電性相反的電極移動，稱為電泳(electrophoresis,簡稱EP)。1937年瑞典科學家Tiselius設計世界上第一台電泳儀，建立”移界電泳法(moving boundary EP)”。由於”移界電泳法”電泳時自由溶液受熱後發生密度變化產生對流，始區帶擾亂，分辨性不高且加上電泳儀器昂貴，不易推廣。故50年間，改進電泳儀及找尋濾紙(paper)、醋酸纖維生素薄膜(cellulose acetate membrane)、澱粉、瓊膠糖(agarose)做為支持介質。60年間更找到聚丙烯醯氨凝膠(polyacrylamide)為支持介質並發展了SDS-polyacrylamide電泳、等電點電泳、雙向電泳和印跡轉移電泳等技術。這些技術具有設備簡單、操作方便、分辨率高等優點。目前，電泳技術已成為生物化學、免疫學、分子生物學以及密切相關的醫學、農、林、牧、魚、製藥、某些工程分析中必不可缺的工具。（註5）
電泳最早是在溶液中進行，但因溶液的擴散現象大，故改用噴濕的濾紙；但又因濾紙與分子間的吸引力大，導致摩擦力太大而發熱，故現今多改用半固態的膠体。（註1、5、8、13、14）
電泳的種類大致分為
a.全液相電泳 (moving- boundary electrophoresis)
如上述已甚少使用，但有些特殊的製備式裝置仍使用類似原理。
b. 帶狀電泳 (zone electrophoresis)
因使用固相的電泳介質，蛋白質樣本電泳後在介質上呈現帶狀 (band)，故稱之。其中因固相材質之不同又分為：
(1)濾紙電泳：濾紙吸附性大，蛋白質很容易變性失活；因此多用在小分子樣本(如胺基酸)或雙向胜汰電泳(蛋白質已水解成胜汰片段)。
(2)薄層電泳：以化學方法修飾纖維素的醇基(乙酸化)成為 cellulose acetate，可降低對蛋白質的吸附，也可塗佈成薄層進行電泳
(thin-layer electrophoresis, TLE)。
(3)膠体電泳：組成膠体的分子長鏈間，有相當大的空間，可降低與蛋白質間的摩擦力，且可增大樣本体積，適用於巨分子電泳，如核酸及蛋白質。例如：
【1】澱粉膠体電泳 (starch gel electrophoresis)
【2】聚丙烯醯胺電泳 (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)
【3】洋菜糖膠体電泳 (agarose
gel electrophoresis)
c. 其它電泳技術（註1、5、8、13、14）
(1) 等電焦集法(isoelectric focusing)：Ampholyte是一種混合物，含有各種連續pI的小分子。若在聚丙烯醯胺膠体內加入ampholyte，通電後ampholyte會在膠体中形成一pH梯度；當樣本中的蛋白質泳動至相等於其pI的pH位置時，其淨電荷會變為零 (pH = pI)，因而焦集於該處不動。因此IEF是依樣本分子pI的不同來作分離，其解析度非常好。
(2) 胜汰圖譜(peptide mapping)：可對蛋白質的特定胺基酸進行水解，得到一群不同長短的胜汰片段。兩個不同蛋白質經同一蛋白脢水解，所得的兩胜汰群，其胜鏈數目、各段胜汰的胺基酸組成與長短均不相同，可鑑定此二蛋白質的相似程度。 反之，不同專一性的蛋白脢會切在不同的胺基酸上，對同一蛋白質會切出不同的胜汰圖譜不同的蛋白質有不同的胜汰圖譜。
(3) 蛋白質轉印(Western blotting)→免疫染色 (immunostainning)
電泳後，若要再對膠体上的蛋白質色帶，做進一步的檢定，則須先轉印到硝化纖維(nitrocellulose)紙，因膠片無法直接進行操作。近來多以尼龍(nylon)取代硝化纖維紙，質地較韌、背景呈色低。 轉印到硝化纖維紙上的蛋白質再以免疫染色法(immunostaining)專一性地染出目標分子。
(4) 製備式電泳(preparative electrophoresis)：製備式電泳通常以不含SDS的原態disc-PAGE進行，以便回收具有活性的蛋白質；蛋白質樣本要先經過部分純化，否則效果不佳，並先以分析式小電泳確定所要色帶的位置。此法可以純化高純度蛋白質。
(5) 免疫電泳(immunoelectrophoresis)：電泳後再以抗体與抗原反應
(6) 毛細管電泳 (capilliary electrophoresis)：最新的電泳儀器，有點像HPLC。
(7) Pulse field gel electrophoresis：利用電場的改變及swtich time的調整來提高分離物質之解析度，用於大分子DNA或染色体之分離。
d.其它相關技術（註1、8、16）
＜染色及乾燥＞
膠片在電泳後要進行染色，才能看到樣本蛋白質所呈現的色帶。下列說明數種常用的蛋白質染色法機制。
a.一般染色法
(1) 硝酸銀 (ammoniacal silver) 染色：以銀氨錯離子形式與蛋白質結合，銀離子再還原成金屬銀的深褐色。其靈敏度比下述CBR染色法高十至百倍，但步驟較繁複。
(2) Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBR) 染色：最常用的染色法，快速而方便，靈敏度中等。利用CBR上的芳香基團與蛋白質的非極性區結合，以及所帶負電與蛋白質的正電基團結合。
b.醣蛋白
醣蛋白 (glycoprotein)上的相鄰醇基，可用過碘酸氧化成醛基後，再以PAS (periodic acid-Schiff's)試劑染成紅色，靈敏度比CBR低，步驟較繁複。這些醛基也可用硝酸銀染上色，步驟稍不同，靈敏度比 Schiff試劑高。
c. 紫外線照射
製備式電泳後，可以用 UV 300 nm 照射之，蛋白質會呈現暗紫色色帶。
d. KCl 沈澱法
SDS-PAGE 中濃度較高的色帶可以用 0.3 M KCl 在 4℃下浸泡 15 min，蛋白質會呈現白色混濁，因為SDS遇鉀形成KDS，溶解度下降之故。
e. 活性染色法
若酵素反應會產生有色物質，則可進行活性染色，但多數酵素須以原態PAGE膠片進行。 可惜大部分的酵素，均無法產生有色的生成物；則或可把膠片分劃，橫切成單位小片(disk)，再以一般的活性測定法，在試管中加入基質液，分析每一小片中所含的酵素活性。這種固相酵素的反應，可以拉長反應時間，以提高生成物濃度，方便偵測。
f. 放射顯像法 (autoradiography)
可檢測樣本中的放射性物質，但要以Ｘ光片壓片顯影。
g. 膠片乾燥法
大部分的膠片均可利用玻璃紙三明治法 行乾燥，效果相當良好，乾燥好的膠片，可用掃瞄機 (scanner) 掃瞄，再以記錄器畫出色帶的位置及高度，與標準品比較則可定量。乾燥後的膠片，再經過熱膠膜護貝後可以長期保存。
電泳原理（註1、5、8、13、14）
a. 泳動率
帶電分子在電場中會被電流移動，是為泳動；其泳動的大小程度稱為泳動率(mobility)。泳動率與所外加電壓、分子的電荷密度成正比，而與其分子摩擦力成反比，而摩擦力決定於此分子之大小、形狀。分子量大者摩擦力大，泳動率小；球形分子摩擦力較小，泳動率大。
b. 蛋白質的帶電性
蛋白質分子上的淨電荷，取決於環境中pH值之高低；若環境中pH值高於其pI，此蛋白質帶淨負電，反之帶淨正電；若剛好等於其pI，其淨電荷則為零(即正電數目等於負電)。同一分子在不同pH值環境下，可能帶不同淨電荷。
c. 蛋白質由負極向正極泳動
電泳系統中，電子由負極流向正極；帶負電的分子往正極跑，帶正電的分子往負極跑，不帶電者則不易泳動。大部分電泳系統的pH值約在8.3，在此pH值下，凡是pI小於8.3的分子均帶負電荷，可以往正極跑。
d. 外在條件影響泳動率的因素
（1）促進泳動：低膠体濃度 (孔徑大)、低濃度緩衝液、高電壓、高電流、高溫。
（2）降低泳動：上述各點的相反條件、樣本含高濃度鹽類、樣本pH太高或太低。
參考資料
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本網頁內容由 生科系 黃詩宜同學提供