樣品的製備

在蛋白質體的研究中，由生物檢體、細胞或細菌培養液萃取出蛋白質的方法有許多種，共同的步驟是弄碎樣品、再用超音波振盪等方法使其均質化，並盡量去除這些組織液、細胞液或菌液的雜質以及其它汙染；由於研究的對象是蛋白質，故要去除的包括脂質、纖維素和核酸……等，這個目的可由加入以下的試劑達成：

1.      界面活性劑（detergents）：像SDS, 3- ([ 3-cholamidopropyl]dimethylammonio)-1-propane sulfonate ) (CHAPS), cholate, Tween)，可以協助將蛋白質與脂質分開，利於膜蛋白的分離。

2.      還原劑（reductants）：如dithiothreitol [DTT], mercaptoethanol, thiourea，可以防止蛋白質氧化並破壞雙硫鍵。

3.      變性劑（denaturing agents）：如尿素和酸性物質，運用離子強度和極端的pH值，阻礙蛋白質二級與三級結構的產生，可以防止蛋白質之間的交互作用（protein-protein interaction）。

4.      酵素：如DNAse、RNAse，用以去除核酸、醣類或脂質。

目前學者們已經研究出由不同樣品中，萃取出蛋白質的方法，有些時候除了上述藥品外，也加入一些蛋白酶的抑制劑，以防止蛋白質在萃取過程被水解。值得注意的是，無論是界面活性劑、還原劑、變性劑，或是蛋白酶抑制劑，不能排除它們對蛋白質體結果分析的影響，如phenylmethylsulfonyl fluoride（PMSF）這種serine protease 的抑制劑，它會影響後續的胰蛋白酶分解作用，界面活性劑也會對蛋白質的分離有負面效果。因此，收集樣品的資料十分重要，必須確定這些試劑的使用，不會對最終的分析造成太大的影響。

下面以萃取貼附性細胞的蛋白質為例，說明大致的實驗過程。

1.      將細胞培養於培養盤中至適當數目。

 

2.      萃取蛋白質時， 在冰上操作，以避免蛋白質的degradation。

 

3.      將培養盤中的培養液移除， 以 PBS （Phosphate Buffer Saline ；0.14M NaCl，2.7mM KCl，1.5mM ，KH₂PO₄，8.1mM Na₂HPO₄）清洗一次

 

4.      加入適量的PBS， 用刮勺(policeman)將培養盤底部的細胞刮下。

 

5.      細胞液置於15 ml離心管中， 以3000rpm離心5 min， 去除上清液後， 加入適量RIPA buffer （RIPA buffer：50mM Tris pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA，1% NP-40， 0.1% SDS， 1mM PMSF，10μg/ml Aprotinin）與細胞混合均勻。

 

6.      冰浴作用30 min， 以12000rpm離心 30 min，取上層液體保存於－20^oC冰櫃待用。

 

7.      如果後續的電泳步驟，要控制加入的蛋白質量，則所萃取之蛋白質樣品，在電泳之前，要以分光光度計(spectrophotometer)測定每一樣品濃度。 先將protein assay dye與去離子水以1：4混合均勻， 固定體積不同濃度（0.25，0.5，1，2 mg/ml）之BSA標準樣品分別與此protein assay dye solution混合均勻，置於分光光度計中， 以595nm蛋白質最大吸光波峰比較其吸光度， 作成一條標準迴歸曲線， 並求得一線性方程式(r²＞0.95才可採用)。 欲測濃度之蛋白質樣品亦以同法處理， 所測得之吸光值即可代入公式求得其濃度。

※參考資料: Daniel C. Liebler   Introduction to Proteomics-Tools for the New Bioloogy p31~34     Humana Press Inc. (2002)

 整理:  施純如